本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
长期以来我国农业增产主要依靠大量化学肥料和农药的投入，不合理施用化肥和农药引起的农业生态环境问题日渐严重。近些年，随着人们保护环境意识的增强及对无公害农产品的日益重视，新技术、新产品研发不断深入，探寻新的生物肥源和生物防治以替代或部分替代化肥和农药的研究倍受关注。因此，微生物肥料在农业中的应用越来越受到重视。复合微生物制剂是近年来研究较多的一种微生物肥料制剂，但仍处于研究和探索阶段。所谓的复合微生物制剂一般由两种或多种微生物按适合比例并同时培养，充分发挥群体联合作用优势，取得最佳应用效果的一种微生物制剂。
芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的芽孢，加之易制成粉剂，便于贮藏运输，利于实现大规模生产，所以是理想的植物促生菌筛选对象。芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际体表或体内与病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质以抑制病原菌生长、同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。
目前，利用单一微生物防治植物病害和促进植物生长的报道较多，但是单一菌株作用机制单一，受环境影响较大。通过促生菌复配可实现多菌株间的优势互补与协同作用，增强其在自然环境中的适应性、竞争力及存活率，充分发挥其促生和生防效果，但目前针对多功能复合芽孢菌剂的研究较少。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种复合微生物菌剂，它包括固氮类芽孢杆菌(paenibacillussp.)1-49、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)b16和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)t600；
固氮类芽孢杆菌(paenibacillussp.)1-49的保藏编号为strainnumbercgmccno.4966；巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)b16的保藏编号为strainnumbercctccm2015750；解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)t600的保藏编号为strainnumbercctccm2015756。
以上复合微生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
1)、种子培养：
先制备种子培养基a、种子培养基b，再用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49种到种子培养基a中，用接种环分别单独接种1环巨大芽孢杆菌b16和1环解淀粉芽孢杆菌t600到两个种子培养基b中，转速为180-220r/min，温度为30-34℃，摇床培养20-24h，进行扩大培养和活化，分别制得环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液；
2)、发酵培养：
先制备发酵培养基，再分别取步骤1)中制得的环固氮类芽孢杆菌1-49种子液10ml、巨大芽孢杆菌b16种子液20ml和解淀粉芽孢杆菌t600种子液10ml加入发酵培养基中并放到发酵罐中发酵，发酵培养基的ph为7.2，发酵罐的通气量和转速分为初期、中期和后期三个阶段，初期的通气量为25-35％，转速为80-120r/min，中期的通气量为40-50％，转速为240-260r/min，后期的通气量为25-35％，转速为80-120r/min，制得复合微生物菌剂。
其中，步骤1)中种子培养基a由以下质量的原料制成：caco31.1-1.4g，mgso4·7h2o0.5-1.2g，k2hpo41.2-2.0g，nacl0.2-0.4g，feso4·7h2o0.002-0.005g，namo4·2h2o0.04-0.1g，蔗糖6-10g，蒸馏水800-1200ml，ph7.1-7.4。
其中，步骤1)中种子培养基b由以下质量的原料制成：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.4。
其中，步骤2)中发酵培养基由以下质量的原料制成：豆饼粉15-20g，玉米淀粉4-8g，蔗糖3-6g，酵母粉1-3g，mgso4·7h2o0.2-0.4g，caco31-2g，mnso4·h2o0.02-0.04g，kh2po40.4-0.7g，蒸馏水800-1200ml。
其中，步骤2)中发酵培养基由以下质量的原料制成：豆饼粉16-28g，玉米淀粉5-6g，蔗糖4-5g，酵母粉2-3g，mgso4·7h2o0.2-0.3g，caco31-2g，mnso4·h2o0.03-0.04g，kh2po40.5-0.6g，蒸馏水1000ml。
其中，步骤2)中环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液的添加量最佳组合通过正交试验确定，种子液添加量最佳组合确定步骤如下：
a、发酵培养
设计三因素两水平的l4(23)正交试验，在发酵培养基中添加不同浓度的步骤1)制得的环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液的不同组合，其中固氮类芽孢杆菌1-49种子液的浓度为10ml/l或15ml/l，巨大芽孢杆菌b16种子液的浓度为15ml/l或20ml/l，解淀粉芽孢杆菌t600种子液的浓度为10ml/l或20ml/l；按正交试验确定4个实验组合，将所得的不同种子液组合的发酵培养基置于发酵罐中发酵，制得发酵液；
b、发酵过程中活菌数测定
分别取步骤a中4个实验组合的20ml的发酵48h后的发酵液，75℃加热15min，再取加热过的发酵液5ml加入45ml无菌水中，摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，再取0.1ml10-2浓度稀释液到无菌固体培养基中并涂匀，32℃于生化培养箱中培养48h，然后数培养皿上的菌落数，分析数据即可筛选得出种子液添加量最佳组合。
其中，步骤1)中转速为200r/min，温度为32℃，摇床培养24h。
其中，步骤2)中发酵罐采用上海保兴全自动发酵罐，发酵罐初期的通气量为30％，转速为100r/min，中期的通气量为45％，转速为250r/min，后期的通气量为30％，转速为100r/min。
复合微生物菌剂在促进甘蔗生长和提高农业节氮效果中的应用。
本发明的有益效果为：(1)本发明以三种具有固氮能力的菌株，制备而成的复合微生物菌剂，节氮效果显著，具有巨大市场优势；
(2)本发明通过正交试验进行液体发酵的不同菌液添加量优化，提高了固氮菌的产孢量，大大提高生产的优质化，能够有效地降低生产成本；
(3)本发明制备的复合微生物菌剂，三种菌种均为芽孢菌，具有储存时间久，货架周期长等优点，在未来的农业生产中，将有良好的应用前景。
具体实施方式
一、生物材料
固氮类芽孢杆菌(paenibacillussp.)1-49的保藏编号为strainnumbercgmccno.4966；巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)b16的保藏编号为strainnumbercctccm2015750；解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)t600的保藏编号为strainnumbercctccm2015756。
2、环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液的添加量通过正交试验确定，种子液添加量最佳组合确定步骤如下：
二、发酵培养
设计三因素两水平的l4(23)正交试验，在发酵培养基中添加不同浓度的步骤1)制得的环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液的不同组合，其中固氮类芽孢杆菌1-49种子液的浓度为10ml/l或15ml/l，巨大芽孢杆菌b16种子液的浓度为15ml/l或20ml/l，解淀粉芽孢杆菌t600种子液的浓度为10ml/l或20ml/l；按正交试验确定4个实验组合，将所得的不同种子液组合的发酵培养基置于发酵罐中发酵，制得发酵液。三因素两水平的l4(23)正交试验见表1、表2。
b、发酵过程中活菌数测定
分别取步骤a中4个实验组合的20ml的发酵48h后的发酵液，75℃加热15min，再取加热过的发酵液5ml加入45ml无菌水中，摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，再取0.1ml10-2浓度稀释液到无菌固体培养基中并涂匀，32℃于生化培养箱中培养48h，然后数培养皿上的菌落数，分析数据即可筛选得出种子液添加量最佳组合。从表3中可以看出，1-49种子液添加水平选t1，b16种子液液添加水平选t2，t600种子液添加水平选t2为最优组合。即1-49种子液添加10ml/l，b16种子液液添加20ml/l，t600种子液添加10ml/l。
表1混合发酵培养基发酵过程中添加种子菌液量水平
表2l4(23)正交试验表
表3不同菌量添加正交试验分析
三、复合微生物菌剂的制备
实施例1。
本实施例的复合微生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
1)、种子培养：
先制备种子培养基a、种子培养基b，再用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49种到种子培养基a中，用接种环分别单独接种1环巨大芽孢杆菌b16和1环解淀粉芽孢杆菌t600到两个种子培养基b中，转速为180r/min，温度为30℃，摇床培养24h，进行扩大培养和活化，分别制得环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液；
2)、发酵培养：
先制备发酵培养基，再分别取步骤1)中制得的的环固氮类芽孢杆菌1-49种子液10ml、巨大芽孢杆菌b16种子液20ml和解淀粉芽孢杆菌t600种子液10ml加入发酵培养基中并放到发酵罐中发酵，发酵培养基的ph为7.2，发酵罐的通气量和转速分为初期、中期和后期三个阶段，初期的通气量为25％，转速为80r/min，中期的通气量为40％，转速为240r/min，后期的通气量为25％，转速为80r/min，制得复合微生物菌剂。
步骤1)中种子培养基a由以下质量的原料制成：caco31.1g，mgso4·7h2o0.8g，k2hpo41.6g，nacl0.2g，feso4·7h2o0.002g，namo4·2h2o0.04-0.1g，蔗糖6g，蒸馏水1000ml，ph7.1。
步骤1)中种子培养基b由以下质量的原料制成：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0。
步骤2)中发酵培养基由以下质量的原料制成：豆饼粉15g，玉米淀粉4g，蔗糖3g，酵母粉1g，mgso4·7h2o0.2g，caco31g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.4g，蒸馏水1000ml。
实施例2。
本实施例的复合微生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
1)、种子培养：
先制备种子培养基a、种子培养基b，再用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49种到种子培养基a中，用接种环分别单独接种1环巨大芽孢杆菌b16和1环解淀粉芽孢杆菌t600到两个种子培养基b中，转速为200r/min，温度为32℃，摇床培养24h，进行扩大培养和活化，分别制得环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液；
2)、发酵培养：
先制备发酵培养基，再分别取步骤1)中制得的环固氮类芽孢杆菌1-49种子液10ml、巨大芽孢杆菌b16种子液20ml和解淀粉芽孢杆菌t600种子液10ml加入发酵培养基中并放到发酵罐中发酵，发酵培养基的ph为7.2，发酵罐的通气量和转速分为初期、中期和后期三个阶段，初期的通气量为30％，转速为100r/min，中期的通气量为，通气量为45％，转速为250r/min，后期的通气量为通气量为30％，转速为100r/min，制得复合微生物菌剂。
步骤1)中种子培养基a由以下质量的原料制成：caco31.2g，mgso4·7h2o1.0g，k2hpo41.8g，nacl0.3g，feso4·7h2o0.004g，namo4·2h2o0.08g，蔗糖8g，蒸馏水1000ml，ph7.2。
步骤1)中种子培养基b由以下质量的原料制成：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0。
步骤2)中发酵培养基由以下质量的原料制成：豆饼粉18g，玉米淀粉6g，蔗糖4g，酵母粉2g，mgso4·7h2o0.3g，caco31.5g，mnso4·h2o0.03g，kh2po40.5g，蒸馏水1000ml。
实施例3。
本实施例的复合微生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
1)、种子培养：
先制备种子培养基a、种子培养基b，再用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49种到种子培养基a中，用接种环分别单独接种1环巨大芽孢杆菌b16和1环解淀粉芽孢杆菌t600到两个种子培养基b中，转速为220r/min，温度为4℃，摇床培养20h，进行扩大培养和活化，分别制得环固氮类芽孢杆菌1-49种子液、巨大芽孢杆菌b16种子液和解淀粉芽孢杆菌t600种子液；
2)、发酵培养：
先制备发酵培养基，再分别取步骤1)中制得的的环固氮类芽孢杆菌1-49种子液10ml、巨大芽孢杆菌b16种子液20ml和解淀粉芽孢杆菌t600种子液10ml加入发酵培养基中并放到发酵罐中发酵，发酵培养基的ph为7.2，发酵罐的通气量和转速分为初期、中期和后期三个阶段，初期的通气量为35％，转速为120r/min，中期的通气量为50％，转速为260r/min，后期的通气量为35％，转速为120r/min，制得复合微生物菌剂。
步骤1)中种子培养基a由以下质量的原料制成：caco31.4g，mgso4·7h2o1.2g，k2hpo42.0g，nacl0.4g，feso4·7h2o0.005g，namo4·2h2o0.1g，蔗糖10g，蒸馏水1000ml，ph7.4。
步骤1)中种子培养基b由以下质量的原料制成：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，ph7.4。
步骤2)中发酵培养基由以下质量的原料制成：豆饼粉20g，玉米淀粉8g，蔗糖6g，酵母粉3g，mgso4·7h2o0.4g，caco32g，mnso4·h2o0.04g，kh2po40.7g，蒸馏水1000ml。
四、复合微生物在促进甘蔗生长和提高农业节氮效果中的应用
1)试验设计
播种时间：2016年3月23日
试验地点：广西南宁市武鸣区
试验面积：总面积200亩，实施例1-3的3个处理组、1个对照组分别为50亩，随机区组设计。
试验设置：推广实验设置4个处理：实施例1-3的制得的复合微生物菌剂处理和空白处理，每亩纯氮施入量，每个处理组比对照组减少6.9公斤，减氮量为33.65％。具体施肥方案见表4和表5。田间管理除施肥方案不同，其它如浇水、打药、除草均一致。详细观察、测定、记录播种时间、地点、气候情况、农艺性状、农艺措施、分蘖情况、产量、工艺成熟期绿叶数量及叶色、投入产出比等指标。
接种方法：共进行二次。
第一次在甘蔗下种前，将菌剂稀释400-500倍(具体浓度看菌剂含量)，浸泡砍好的蔗种15-30分钟后下种。注意不要使用消毒农药，菌剂用量为亩用量的50％左右；
第二次在甘蔗苗期，结合催苗肥将菌剂与尿素混合施用。菌剂用量为亩用量的50％左右。
表4处理组施肥及接种方案
表5对照组施肥方案
2)试验结果
表6甘蔗农艺性状测定结果表
2016年11月18日工作人员对试验田甘蔗进行农艺性状测定，包括株高、茎径、有效茎、节间数、蔗茎产量以及含糖量等指标，结果发现，如表6甘蔗农艺性状测定结果表所示，在减氮量为33.65％的水平下处理组蔗茎产量比对照组增加了11.91％，含糖量提高了30.97％，大大促进甘蔗生长，显著提高农业节氮效果，在未来的农业生产中，将有良好的应用前景。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。