双特异性磷酸酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用的制作方法

本发明属于双特异性磷酸酶(dusp4)应用技术领域，具体涉及一种双特异性磷酸酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用。

背景技术：

2型糖尿病严重威胁人类健康，其新药研制一直是科研和开发领域的热点，尤其以蛋白类药物开发更为引人注目。在众多的候选蛋白中，成纤维细胞生长因子21(fgf21)是一个研发热点。研究发现，fgf21重组蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、减轻体重、降低血糖、显著减轻2型糖尿病及其并发症。在药物研发中，建立一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物的关键，因此，建立一个客观评价fgf21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测体系也是fgf21研发中的一个重要环节。

目前，普遍采用的fgf21活性检测方法是细胞的葡萄糖摄取测定：该方法通过葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖来测定，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖无法进入后续代谢步骤，因而会在细胞中聚集，直接成比例地反映细胞的葡萄糖摄入水平：该方法检测过程中一是使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，对于实验防护和环境保护要求较高；另外检测方法中使用荧光检测方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，该方法价格昂贵，不利于高通量筛选使用，同时该检测还受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。因此，研发新的fgf21功能检测的体系不仅可弥补葡萄糖摄取测定的不足，而且有望获得更为简便可靠的检测方法，这对于客观评价fgf21重组蛋白效果具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双特异性磷酸酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组fgf21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。

本发明所采用的技术方案是，双特异性磷酸酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用。

本发明的特征在于，

双特异性磷酸酶的基因表达水平与人重组fgf21蛋白的添加浓度的关系为：双特异性磷酸酶基因表达水平随人重组fgf21蛋白的添加浓度的增加而增大。

本发明所采用的另一个技术方案是，用于判断人重组fgf21蛋白活性的双特异性磷酸酶，其特征在于，所述的双特异性磷酸酶的引物序列为：

上游引物：5’-cctgcttaaaggtggctatgaga-3’；

下游引物：5’-agtacttgcgctcaggagga-3’。

本发明的特征还在于，

双特异性磷酸酶表达被人重组fgf21蛋白上调，且呈剂量依赖性升高。

双特异性磷酸酶为脂肪细胞内的双特异性磷酸酶。

本发明的有益效果是：本发明通过人重组fgf21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)检测脂肪细胞的基因表达，从而确定脂肪细胞双特异性磷酸酶表达水平可成为fgf21活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。

附图说明

图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；

图2是本发明定量pcr观察dusp4和beta-actin基因的扩增曲线图；

图3是本发明pcr产物的溶解曲线；

图4是本发明人重组fgf21对dusp4基因表达的影响图；

图5是本发明人重组fgf21对dusp4基因表达的的量效关系图；

图6是本发明人重组fgf21受体抑制剂对fgf21作用的抑制效应图。

具体实施方式

本发明基于脂肪细胞dusp4基因表达的人重组fgf21蛋白活性检测方法，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、细胞培养和处理：小鼠前体脂肪细胞细胞种植于12孔培养板中，在37℃孵箱培养，所用培养液为普通培养液即dmem培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清，每2天更换新鲜培养液；当细胞生长至接触抑制2天后，更换到诱导培养液，诱导培养液为dmem培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清、0.3iu/ml胰岛素、20μmol/l地塞米松和20μmol/l罗格列酮，处理2天后；更换到胰岛素培养液，胰岛素培养液为dmem培养液，其中加入体积分数为10％的新生牛血清和0.3iu/ml胰岛素，继续培养2天后；更换到普通培养液中继续培养，细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积，向脂肪细胞转化，每2天更换新鲜培养液，6天后细胞用于fgf21处理。如图1所示，细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积，转变为成熟的脂肪细胞。

在脂肪细胞培养液中分别加入不同浓度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml人重组fgf21蛋白，处理12小时后，3t3-f422脂肪细胞用于rna提取。

二、脂肪细胞rna提取和反转录：将12孔板中的培养液去除干净，每孔加入350μl裂解液rl，用细胞研磨棒研磨裂解，再将所有溶液转移至过滤柱cs中12000rpm离心2min，收集滤液；再向滤液中加入350μl70％乙醇，混匀并转入吸附柱cr3中12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室温放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；重复向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱cr3转入rnase-free离心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到rna溶液。

酶标仪检测rna浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。在八连管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分别加入1μlgdnaeraser，再分别加入1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o补足至10μl，混匀，室温反应5min。在各管中分别加入以下试剂，4μl5xprimescriptbuffer2，4μlrnasefreedh2o，1μlprimescriptrtenzymemixi，1μlrtprimermix，总反应体系为20μl，混匀。反应条件为37℃15min，85℃，5s。反应完成后将cdna存于4℃备用，长期保存时转入-20℃。

三、dusp4表达水平的检测：dusp4基因表达水平采用定量pcr方法检测，以beta-actin基因的表达作为参考基因。在八连管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μldusp4引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，总反应体系为20μl，混匀。

反应条件是：第一步是94℃、5min，第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min循环进行40次，第三步是进行加温溶解扩增产物，获得溶解曲线。

dusp4引物序列是：

上游引物：5’-cctgcttaaaggtggctatgaga-3’；

下游引物：5’-agtacttgcgctcaggagga-3’。

beta-actin的引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’；

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

以beta-actin基因表达为参考，对实验结果进行表达水平分析：如图2所示，随着扩增次数的增加，dusp4和beta-actin基因的拷贝数在一定扩增次数后呈指数增加，最后到达平台期；如图3所示，溶解曲线表现单峰，说明扩增产物的特异性强；如图4所示，人重组fgf21(美国peprotech公司产品，浓度100ng/ml)处理细胞12小时可显著增加脂肪细胞内dusp4的表达(**表示统计学分析p<0.01，n＝6)；如图5所示，dusp4表达随人重组fgf21(美国peprotech公司产品，处理细胞12小时)浓度的增加而增加，表现为良好的量效关系；如图6所示，进行了4组实验，一组为对照组即空白组，二组加入人重组fgf21蛋白，三组加入人重组fgf21蛋白抑制剂azd4547，四组同时加入人重组fgf21蛋白和抑制剂azd4547，结果表明，人重组fgf21受体抑制剂azd4547(美国mce公司产品，浓度10nmol/l)处理后显著抑制fgf21对dusp4表达的作用(**表示统计学分析p<0.01，n＝6)。

四、扩增特异性的鉴定：把定量pcr扩增产物进行dna测序，dusp4测序结果如下：

“cctgcttaaaggtggctatgagaggttttcttctgaatacccagaattctgctctaaaaccaaggccctggccgccatcccaccccctgtacctcccagca”。

扩增片段大小为103bp，与美国国家生物技术信息中心报道的dusp4mrna(序号：nm176933.4)的554-656碱基序列完全一致。

根据以上实验结果发现，双特异性磷酸酶(dualspecificityphosphatase4，dusp4)表达被人重组fgf21上调，且呈剂量依赖性升高，脂肪细胞dusp4表达水平可成为fgf21活性检测的新指标。