本发明属于真菌类生物技术领域，特别是涉及到一种松露菌代谢产物的制备方法。
背景技术：
松露菌truffle,是子实体在地下土壤中生长并成熟，又被称作块菌。松露菌在分类上隶属于子囊菌门(ascomycota)，盘菌(pezizomycetes)，盘菌目(pezizales)，块菌科(tuberaceae)。松露菌是大型真菌中最为珍贵的食用菌之一。含有丰富的营养物质及多种易被人体吸收的氨基酸和无机盐。因此欧洲人将松露称为地下黄金、黑色金钢石与鱼子酱、鹅肝并列“世界三大珍肴”。松露对生长环境的要求极其苛刻，且无法人工培育，产量稀少，特别昂贵。因此松露的食药用价值亟需要一种新型的技术方案来开发确认。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种松露菌代谢产物的制备方法，采用液体深层发酵等技术，对松露菌在发酵中代谢的产物进行低成本、易掌握、保质实用的制备，保证松露菌发酵代谢产物的供应。
一种松露菌代谢产物的制备方法包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，
步骤一、斜面培养
将从野生松露菌中分离出的松露菌菌株，以10％的接种量接种入ph值为6～6.5的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间为8天～10天；
步骤二、液体深层发酵种子培养
将所述步骤一中培养后的松露菌菌株接种至摇瓶，斜面与摇瓶的接种量比为1：2，摇瓶内置液体培养基，进行液体深层发酵种子培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间5天～7天；
步骤三、种子罐培养
向10l清洁无菌的种子罐内装入占罐内容积50％的培养基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高压蒸汽灭菌0.3小时～0.5小时，其中蒸汽的温度为120℃～125℃，冷却至室温后，无菌操作接入所述步骤二中培养后的菌种，进行种子罐发酵培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间8天～10天；
步骤四、大发酵罐扩繁培养
向100l清洁无菌的种子罐内装入占罐内容积50％的培养基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高压蒸汽灭菌0.3小时～0.5小时，其中蒸汽的温度为120℃～125℃，冷却至室温后备用，
将所述步骤三培养好的菌种无菌操作移入大发酵罐，进行大罐培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间8天～10天，获得大罐发酵产物；
步骤五、发酵产物提取浓缩
将所述步骤四中获得的大罐发酵产物用离心机分离，得到滤液ⅰ及菌丝ⅰ，将菌丝ⅰ与清水按体积比1：4的比例混合静止0.3小时后水提0.7小时，用200目滤布过滤得到滤液ⅱ，
将滤液ⅰ与滤液ⅱ混合并放入减压浓缩装置，设置减压浓缩装置的压强参数为60kpa～70kpa，加热温度为50℃～60℃，浓缩至溶液含水量为30％，得到松露菌发酵产物浓缩液。
所述步骤二中摇瓶内所用的液体培养基ph值为6～6.5，液体培养基成分为1000份的水、5份的蛋白胨、2.5份的酵母膏、40份的蔗糖、2份的kh2po4和2份的mgso4·7h2o。
所述步骤三种子罐培养所用的培养基与步骤二中所用的培养基相同，接种量为所用的培养基体积的8％～10％。
所述步骤四大罐培养所用的培养基与步骤二中所用的培养基相同，接种量为所用的培养基体积的8％～10％。
所述步骤五中离心机的离心速率为8000转/分钟，离心时间为5分钟。
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：
本发明公开的一种松露菌代谢产物的制备方法，设计的工艺路线合理，投入的成本低，生产周期短，扩大生产率高，代谢产物稳定的特点。经松露菌发酵代谢产物对更年期动物的内分泌失调、生殖系统和行为学等方面进行药理活性及有效剂量进行测试证明松露菌发酵产物对更年期综合症有药理活性，疗效显著。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：
图1为本发明一种松露菌代谢产物的制备方法的流程框图。
具体实施方式
如图所示，一种松露菌代谢产物的制备方法，包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，
步骤一、斜面培养
将从野生松露菌中分离出的松露菌菌株，以10％的接种量接种入ph值为6～6.5的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间为8天～10天；
步骤二、液体深层发酵种子培养即摇瓶培养
将所述步骤一中培养后的松露菌菌株，按照斜面与摇瓶之比为1：2的接种量，接种至摇瓶，摇瓶内置液体培养基，进行液体深层发酵种子培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间5天～7天；
步骤三、种子罐培养
10l种子罐清洗干净后向罐内装入罐体容积50％的培养基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高压蒸汽灭菌0.3小时～0.5小时，蒸汽温度为温度为120℃～125℃，冷却至室温后，无菌操作接入所述步骤二中培养后的菌种，进行种子罐发酵培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间7天～10天；
步骤四、大发酵罐扩繁培养
100l大罐清洗干净后向罐内装入罐体容积50％的培养基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高压蒸汽灭菌0.3小时～0.5小时，蒸汽温度为温度为120℃～125℃，冷却至室温后备用。将移种管路联接在种子罐与大发酵罐上，通入蒸气对移种管路进行灭菌0.2小时～0.3小时，冷却后将步骤三培养好的菌种通过压力差移入大发酵罐，进行大罐培养，培养温度为22℃～28℃，培养时间7天～10天；
步骤五、发酵产物提取浓缩
将大罐发酵产物用离心机分离，离心机设置为离心速率为8000转/分钟，离心时间为5分钟，得到滤液ⅰ及菌丝ⅰ。将菌丝与清水按体积比1：4的比例混合静止0.3小时后水提0.7小时，200目滤布过滤得到滤液ⅱ，将滤液ⅰ与滤液ⅱ混合后，放入减压浓缩装置，设置减压浓缩装置的压强参数为60kpa～70kpa，加热温度为50℃～60℃，浓缩至溶液含水量为30％，得到松露菌发酵中代谢产物浓缩液；
所述步骤二中摇瓶内所用的液体培养基ph值为6～6.5，液体培养基成分为1000重量份的水、5重量份的蛋白胨、2.5重量份的酵母膏、40重量份的蔗糖、2重量份的kh2po4、2重量份的mgso4·7h2o。
所述步骤二液体深层发酵种子培养之后直接进行步骤三种子罐培养，再进行大罐移种发酵培养，其中种子罐与大罐培养所用的培养基与步骤二中所用的培养基相同，菌种为初始菌种，染菌率低，扩大生产率稳定。接种量为所用培养基体积的8％～10％，培养温度为22℃～28℃，培养时间为7天～10天。
松露菌具有以下性质：
1、菌落外观：菌丝网状、较长、气生菌丝发达、白色。
2、镜检：(1)菌丝粗壮，呈细长圆柱形。
(2)美蓝单染色着色深，均匀。
(3)可见大量生长点，有空泡。
(4)有锁状联合，且较发达。
(5)无杂菌污染。
3、生理生化特征：
(1)菌丝生长最佳温度22℃～28℃。
(2)生长最佳ph值6～6.5。
(3)对氧的需求：属好氧性真菌。
(4)培养基生长最佳水分95％。
4、培养基成分：pda综合培养基。
根据实验结果表明，该松露菌属于块菌科块菌属。本发明的松露菌种传代18次以上不退化，属于抗老化能力、稳定性及代谢能力都很强的菌株。
利用分离后的松露菌菌株进行深层发酵采用固态分离-液态发酵-液态提取的工艺路线，包括如下步骤：
斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、大罐培养、浓缩提取。
所述的斜面培养，所选用的培养基为pda综合培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，ph值6～6.5，培养温度22℃～28℃，培养时间8天～10天。
所述的液体深层发酵种子培养即摇瓶培养，摇瓶内所用的液体培养基成分重量百分比为1000g水内包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，液体培养基ph值6～6.5，斜面与摇瓶接种量之比为1：2，培养温度22℃～28℃，培养时间5天～7天。
所述的种子罐培养：种子罐内装入培养基为罐体容积50％，种子罐内所用的液体培养基成分重量百分比为1000g水内包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，液体培养基ph值6～6.5，接种量为培养基体积的10％，培养温度为22℃～28℃，空气流量0.6v/v，罐压0.2㎏/㎝2培养时间7天～10天；
所述的大罐培养：迅速增加菌丝体数量，大罐内装入培养基为罐体容积的50％，大罐内所用的液体培养基成分重量百分比为1000g水内包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，液体培养基ph值6～6.5，接种量为培养基的10％，温度22℃～28℃，空气流量0.6v/v，罐压0.4㎏/㎝2，培养时间为7天～10天。
实施例1
斜面菌种培养：采用pda综合培养基，ph6.3，培养温度24℃。该菌萌发快，菌种接后2.5天内形成以基点的明显菌落，10天菌落长满管。菌丝初期褐色，网状，分枝多。通过镜检明显观察到菌丝粗壮，分枝多，锁状联合发达，美蓝单染色着色深，可见大量生长点，有空泡，无杂菌污染。
液体深层发酵种子培养：
摇瓶内所用的液体培养基成分重量百分比为1000g水内包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，ph值6.3，高压压力1.2kg/㎝2灭菌30min，冷却后接种，接种量为斜面与摇瓶之比1：6，即一个斜面接6个500ml的摇瓶(装量150ml)，培养温度26℃～27℃，旋转式摇床150转/分钟，培养7天，菌球湿重达20％以上。其中，湿重测定方法：取100ml培养液置于量筒中，静置15min，观察菌球沉降的刻度的百分数。菌球味为特殊香味，稍酸，镜检观察到菌丝着色深，粗壮，分枝多，生长点明显可见，有锁壮联合，未见杂菌污染，即可作为种子罐培养备用。
种子罐培养：培养基与摇瓶种子培养基相同，装入培养基量为罐体的50％，ph值6.3，高压压力1.2kg/㎝2灭菌30min，冷却后接种，接种量为培养基的10％，温度26℃～27℃，空气流量0.6v/v，罐压0.2kg/㎝2，培养7天，当外观形态检查到菌球湿重达30％以上，味感特殊香味，镜检观察到菌丝着色深，粗壮，分枝多，生长点明显可见有锁状联合，未见杂菌污染即可进行大罐培养。
大罐培养所用培养基配方种子罐培养基相同，装入培养基量为罐体的50％，ph值6.3，高压压力1.2kg/㎝2灭菌30min后将移种通道连接好，通入蒸气20min，灭菌冷却后进行移种，移种量为培养基的10％。ph值6.3，温度26℃～27℃，空气流量0.6v/v，罐压0.4kg/㎝2，培养7天，当外观形态检查到菌球湿重达30％以上，味感特殊香味，镜检观察到菌丝着色深，粗壮，分枝多，生长点明显可见有锁状联合，未见杂菌污染即可进行放罐。
外观检查，培养基呈粥状，菌丝黄白、细腻，内含部分菌球，直径0.2-0.5mm，无杂菌污染.镜检菌丝着色深，粗壮，分枝多，有锁状联合，生长点明显可见。
提取浓缩：将松露菌发酵后的代谢产物用离心机分离，离心速率为8000转/分钟，离心时间为5分钟。得到滤液ⅰ及菌丝ⅰ。将菌丝ⅰ与清水按1：4的体积比混合静止0.3小时后水提0.7小时，200目滤布过滤得到滤液ⅱ，将滤液ⅰ与滤液ⅱ混合后，放入减压浓缩装置，设置减压浓缩装置的压强参数为60kpa～70kpa，加热温度为50℃～60℃，浓缩至溶液含水量为30％，得到松露菌发酵代谢产物浓缩液；
本发明采用液体深层发酵等技术，均根据所开发菌种的特点，依照低成本、易掌握、保质实用原则，依托现有可行完善工艺，合理组合、优化选择，建立最佳生产工艺路线。
实施例2：
药理测试：松露菌发酵代谢产物对更年期动物的内分泌失调、生殖系统和行为学等方面进行药理活性及有效剂量进行测试，报告结果如下：
1.发酵产物对摘除卵巢小鼠雌激素及子宫系数的影响。
与正常对照组比较，模型组血清e2(雌二醇)水平明显降低(p<0.01)，子宫系数降低，表明模型成立。给药组与模型组比较，25ml/kg剂量组能够明显增加子宫重量，提高子宫系数，25.20ml/kg剂量组显著升高e2水平。结果见表1。
表1样品对摘除卵巢小鼠雌激素及子宫系数的影响
与模型组比较*p<0.05,**p<0.01
2.发酵产物对小鼠足跖部汗腺分泌的影响
与青年组比较，更年组汗点数明显增加(p<0.05),样品25ml/kg剂量组与更年给比较，汗点数明显减少，其他剂量组同更年组比较变化不明显。结果见表2。
表2样品对大鼠足跖部汗腺分泌的影响
与更年组比较：*p<0.05
3.发酵产物对更年期小鼠自主活动的影响
样品0.25及0.2ml/10g体重剂量组与更年组比较，能明显减少更年期小鼠活动次数(p<0.05)。结果见表3。
表3样品对更年期小鼠自主活动的影响
与更年组比较：*p<0.05
结论:
更年期综合症指妇女绝经前后出现性激素波动或减少所致的一系列以自主神经系统功能紊乱为主，伴有神经心理症状的一组症候群。更年期综合症的发生是随着女性生殖年龄过渡到老年阶段而引起的，是由于卵巢功能衰退、性激素分泌降低，促性腺激素升高，致神经、内分泌功能整体性失调，尤以下丘脑自主神经中枢调节功能紊乱为主，交感-肾上腺系统亢进，而出现的一系列临床体征。e2是女性卵巢成熟滤泡分泌的一种雌激素，绝经后卵泡数目减少，功能衰退，雌激素水平下降，e2水平的下降可导致动物子宫萎缩，使子宫湿重、子宫系数明显降低。本结果显示：发酵产物25ml/kg剂量组能明显提高雌二醇含量，增加子宫系数。
临床上更年期症状主要表现为心烦不寐，烘热汗出，口干咽噪，烦躁易怒和失眠多梦等阴虚火旺症状，本结果表明发酵产物能够减少老年小鼠自主活动次数，减少摘除卵巢鼠汗液的分泌，改善更年期症状，可以提高机休雌激素水平。
综上所述，松露菌发酵中的代谢产物可明显提高雌激素水平，增加子宫系数，减少自主活动次数，减少汗液分泌。可改善更年期综合症的临床症状。松露菌发酵产物对更年期综合症有药理活性，疗效显著。