本发明涉及饲料原料深加工技术领域，尤其涉及一种棉粕复合菌种发酵剂、其制备方法及其应用方法。
背景技术：
棉粕营养价值较高且价格比较低廉，是一种极具开发潜力的植物蛋白质资源，可填补我国饲料行业蛋白质资源供应的缺口。但棉粕在饲料行业中常被限制使用，其主要原因是有较高含量的游离棉酚、蛋白消化率较低、氨基酸不平衡以及适口性较差。行业内对棉粕加工的方法繁多，目前主要有化学法、萃取法、膨化法，而大多数的加工方法，不是因为加工后的棉粕适口性差、消化率没有得到有效改善，就是因为设备投入大、生产成本高或对环境污染大等原因，而无法规模化对棉粕进行脱酚处理。与此同时，市面上也有一些菌种发酵剂产品出售，主要是利用微生物对棉粕进行发酵处理来降低棉粕中棉酚含量，但脱酚效果及对棉粕蛋白消化吸收率的改善效果不显著，棉粕饲用价值并无有效的提高。
例如，中国专利cn201510232514.4公开了一种固态发酵棉粕的制备方法，该专利使用的菌种为酵母菌、枯草芽孢杆菌及植物乳杆菌，其中主要降解游离棉酚的菌种为枯草芽孢杆菌，因此在该菌种复配过程中添加比例达到了50％，发酵产品可能会因枯草芽孢杆菌的添加量过高，而引起最终产品风味芽孢味重，导致动物的采食量下降。另一方面，该专利需对棉粕原料进行高温、高压预处理，再对棉粕进行微生物发酵，最终产品的游离棉酚含量才得以降低，该过程需要较大的设备投入和能源投入，生产成本较高，无法规模化对棉粕进行脱酚处理。
因此，市面上急需一种能够规模化处理棉粕的产品，全面地提升棉粕的饲料利用价值及经济价值。
因此，如何针对上述现有技术所存在的缺点进行研发改良，实为相关业界所需努力研发的目标，本发明设计人有鉴于此，乃思及创作的意念，遂以多年的经验加以设计，经多方探讨并试作样品试验，及多次修正改良，乃推出本发明。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题，本发明提供了采用优选菌种的降解棉粕游离棉酚的复合菌种发酵剂、其制备方法及使用方法。
(二)技术方案
本发明提供了降解棉粕游离棉酚的复合菌种发酵剂，包括如下质量份数的配方组分：
产脘假丝酵母3～4份；
纳豆芽孢杆菌0.5～1份；
嗜酸乳杆菌0.5～1份。
在本发明的一些实施例中，包括如下质量份数的组分：
产脘假丝酵母3份，纳豆芽孢杆菌0.5份，嗜酸乳杆菌0.5份。
在本发明的一些实施例中，所述产脘假丝酵母购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc31071。
在本发明的一些实施例中，所述纳豆芽孢杆菌购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc10262。
在本发明的一些实施例中，所述纳豆芽孢杆菌购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc10262。
本发明还提供了上述降解棉粕游离棉酚的复合菌种发酵剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)一级种子液制备：分别将产脘假丝酵母、纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌各菌种斜面洗脱于对应装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在培养箱中恒温培养20～24h；纳豆芽孢杆菌在摇床中培养20～24h；产脘假丝酵母菌在摇床中培养24～30h；培养结束后即为一级种子液；
(2)二级种子液制备：将上述一级种子液，分别以5％～10％的接种量添加到装有对应二级培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在培养箱中恒温培养10h～20h；纳豆芽孢杆菌在摇床中培养10h～18h；产脘假丝酵母在摇床中培养20h～24h；形成二级种子液；
(3)三级种子液制备：将上述二级种子液，分别以5％～10％的接种量添加到装有对应液体培养基的发酵罐中，嗜酸乳杆菌在发酵罐中恒温培养10h～20h；纳豆芽孢杆菌在发酵罐中培养10h～18h；酵母菌在发酵罐中培养20h～24h；培养结束后即为三级种子液；
(4)混合：将三级种子液均匀混合，制成复合菌种发酵剂。
在本发明的一些实施例中，所述产脘假丝酵母二级菌种培养基包括以下质量百分比的组分：糖蜜3％，硫酸铵0.5％～1％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％及酵母提取物0.05％，其余为水。
在本发明的一些实施例中，所述嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌二级培养基包括以下质量百分比的组分：糖蜜4％，硫酸铵0.5％～1％，其余为水。
在本发明的一些实施例中，产脘假丝酵母三级菌种培养基包括以下质量百分比的组分：糖蜜3％，硫酸铵0.5％～1％％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％，其余为水。
在本发明的一些实施例中，所述嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌三级菌种培养基包括以下质量百分比的组分：糖蜜4％、硫酸铵1～0.5％，其余为水。
本发明还提供了上述降解棉粕游离棉酚的复合菌种发酵剂的应用方法，包括如下步骤：
(1)该复合菌种发酵剂与棉粕堆积发酵，在以下发酵条件进行棉粕固态发酵：发酵温度28～35℃，发酵时间72～96h，料液比为1∶0.8～1；
(2)发酵结束后，对棉粕进行烘干、粉碎。
在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，该复合菌种发酵剂以5％接种量添加到棉粕中。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明至少具有以下有益效果其中之一：
(1)本发明的复合菌种发酵剂是从乳酸菌属、芽胞菌属和酵母菌属中筛选出最为适合的高棉酚含量棉粕发酵菌种，并以组合发酵的形式配制成棉粕复合菌种发酵剂；复合菌种发酵剂能够高效地降解棉粕中游离棉酚、将棉粕的大分子物质发酵降解为容易被动物胃肠道消化吸收利用的小分子物质、快速降低ph、改善产品风味、提高饲料适口性和利用转化率，从而全面地提升了棉粕的饲料利用价值及经济价值。
(2)在棉粕固态发酵过程中，发酵剂中的产脘假丝酵母通过细胞对游离棉酚的分解代谢，可大幅度降低棉粕中游离棉酚含量，同时产脘假丝酵母在发酵过程中产生的菌体蛋白，可显著提高棉粕中真蛋白含量，其代谢出的酒精与乳酸菌代谢的有机酸反应后产生的酯类物质，使得棉粕发酵后具有浓郁的酸香、酒香、酯香味，可使动物的采食量显著提高；纳豆芽孢杆菌能产生多种蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，并降解棉粕中某些复杂的碳水化合物，从而提高棉粕的饲料转化率；嗜酸乳杆菌代谢出的各种有机酸，能显著降低棉粕的ph，避免大肠杆菌、沙门氏菌等有害微生物的生长，同时提高了棉粕在动物胃肠道中的消化、吸收率。
(3)通过单菌株适宜生长条件下的培养，发酵一定的时间保证各菌种均处于对数生长期，此时活菌数高、菌种活力强。
(4)通过一定的接种量及适宜的发酵条件培养，发酵一定的时间保证各菌种均处于对数生长期，此时活菌数高、菌种活力强。
(5)二级、三级菌种培养基中将甜菜加工的副产物糖蜜做为主要的碳源，大大降低了菌种生产的成本。
(6)使用该发酵剂时，不需要对棉粕进行高温、高压等方式预处理，可直接与棉粕混合发酵，处理效率高，便于规模化处理棉粕。
(7)通过本产品处理后的棉粕，具有浓郁的酸香、酒香、酯香味，颜色为黄褐色，提高动物采食量10％以上，游离棉酚的降解率≥70％，粗蛋白≥48％，氨基酸含量≥39％，消化吸收率≥88％，ph＜5.0。
具体实施方式
本发明提供了棉粕复合菌种发酵剂、其制备方法及其使用方法。本产品不需要对棉粕进行高温、高压等方式预处理，可直接与棉粕混合发酵，处理效率高，便于规模化处理棉粕；通过本产品处理后的棉粕，具有浓郁的酸香、酒香、酯香味，颜色为黄褐色，提高动物采食量10％以上，游离棉酚的降解率≥70％，粗蛋白≥48％，氨基酸含量≥39％，消化吸收率≥88％，ph＜5.0。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，各实施例的中的参数，在不产生冲突的情况下，可以重新组合出新的方案。
实施例1
该棉粕复合菌种发酵剂的制备方法如下：
步骤一：选取降酚能力强、代谢产物风味佳的产脘假丝酵母一株cicc编号为31071、产酶能力强的纳豆芽孢杆菌一株cicc编号为10262，产酸能力强的嗜酸乳杆菌一株cicc编号为22150。
步骤二：分别将各菌种斜面洗脱于500ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养20h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养20h；产脘假丝酵母菌在28℃、180rpm摇床中培养24h。培养结束后即为一级种子液。
嗜酸乳杆菌一级培养基为mrs肉汤培养基；纳豆芽孢杆菌一级培养基为lb培养基；产脘假丝酵母一级培养基为麦芽汁培养基。
步骤三：将上述一级种子液，分别以5％的接种量添加到2000ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养10h；纳豆芽孢杆菌在28℃、120rpm摇床中培养10h；产脘假丝酵母在28℃、180rpm摇床中培养20h。培养结束后即为二级种子液。
产脘假丝酵母二级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵0.5％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌二级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵0.5％。
步骤四：将上述二级种子液，分别以5％的接种量添加到50l装有对应液体培养基的发酵罐中，嗜酸乳杆菌在37℃发酵罐中恒温培养10h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120转/min、通气量1m3/h发酵罐中培养10h；酵母菌在28℃、180rpm、通气量1m3/h发酵罐中培养20h。培养结束后即为三级种子液。
产脘假丝酵母三级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵0.5％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌三级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵0.5％。
步骤五：将三级种子液，按产脘假丝酵母∶纳豆芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌质量比为3∶0.5∶0.5的复配比例，均匀混合成复合菌种发酵剂。
该棉粕复合菌种发酵剂的使用方法：将复合菌种发酵剂，以接种量5％、发酵温度28℃、发酵时间72h、料液比1∶0.8发酵条件进行棉粕固态发酵，发酵结束后，对其烘干、粉碎。
实施例2
步骤一：与实施例1的步骤一相同。
步骤二：分别将各菌种斜面洗脱于500ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养22h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养22h；产脘假丝酵母菌在28℃、180rpm摇床中培养17h。培养结束后即为一级种子液；
步骤三：将上述一级种子液，分别以7.5％的接种量添加到2000ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养15h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养14h；产脘假丝酵母在28℃、180rpm摇床中培养22h。培养结束后即为二级种子液。
产脘假丝酵母二级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵0.75％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌二级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵0.75％。
步骤四：将上述二级种子液，分别以7.5％的接种量添加到50l装有对应液体培养基的发酵罐中，嗜酸乳杆菌在37℃发酵罐中恒温培养15h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120转/min、通气量1m3/h发酵罐中培养14h；酵母菌在28℃、180rpm、通气量1m3/h发酵罐中培养22h。培养结束后即为三级种子液。
产脘假丝酵母三级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵0.75％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌三级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵0.75％。
步骤五：将三级种子液，按产脘假丝酵母∶纳豆芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌质量比为3.5∶0.75∶0.75的复配比例，均匀混合成复合菌种发酵剂。
该棉粕复合菌种发酵剂的使用方法：将复合菌种发酵剂，以接种量5％、发酵温度32℃、发酵时间84h、料液比1∶0.9发酵条件进行棉粕固态发酵，发酵结束后，对其烘干、粉碎。
实施例3
步骤一：与实施例1的步骤一相同。
步骤二：分别将各菌种斜面洗脱于500ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养24h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养24h；产脘假丝酵母菌在28℃、180rpm摇床中培养30h。培养结束后即为一级种子液；
步骤三：将上述一级种子液，分别以10％的接种量添加到2000ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养20h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养18h；产脘假丝酵母在28℃、180rpm摇床中培养24h。培养结束后即为二级种子液。
产脘假丝酵母二级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵1％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌二级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵1％。
步骤四：将上述二级种子液，分别以10％的接种量添加到50l装有对应液体培养基的发酵罐中，嗜酸乳杆菌在37℃发酵罐中恒温培养20h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120转/min、通气量1m3/h发酵罐中培养18h；酵母菌在28℃、180rpm、通气量1m3/h发酵罐中培养24h。培养结束后即为三级种子液。
产脘假丝酵母三级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵1％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌三级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵1％。
步骤五：将三级种子液，按产脘假丝酵母∶纳豆芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌质量比为4∶1∶1的复配比例，均匀混合成复合菌种发酵剂。
该棉粕复合菌种发酵剂的使用方法：将复合菌种发酵剂，以接种量5％、发酵温度35℃、发酵时间96h、料液比1∶1发酵条件进行棉粕固态发酵，发酵结束后，对其烘干、粉碎。
实施例4
步骤一：与实施例1的步骤一相同。
步骤二：分别将各菌种斜面洗脱于500ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养24h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养24h；产脘假丝酵母菌在28℃、180rpm摇床中培养30h。培养结束后即为一级种子液；
步骤三：将上述一级种子液，分别以10％的接种量添加到2000ml装有对应液体培养基的三角瓶中，嗜酸乳杆菌在37℃培养箱中恒温培养20h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120rpm摇床中培养18h；产脘假丝酵母在28℃、180rpm摇床中培养24h。培养结束后即为二级种子液。
产脘假丝酵母二级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵1％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌二级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵1％。
步骤四：将上述二级种子液，分别以10％的接种量添加到50l装有对应液体培养基的发酵罐中，嗜酸乳杆菌在37℃发酵罐中恒温培养20h；纳豆芽孢杆菌在30℃、120转/min、通气量1m3/h发酵罐中培养18h；酵母菌在28℃、180rpm、通气量1m3/h发酵罐中培养24h。培养结束后即为三级种子液。
产脘假丝酵母三级菌种培养基：糖蜜3％，硫酸铵1％，蛋白胨0.5％，尿素0.5％，酵母提取物0.05％；嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌三级菌种培养基：糖蜜4％，硫酸铵1％。
步骤五：将三级种子液，按产脘假丝酵母∶纳豆芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌质量比为3∶0.5∶0.5的复配比例，均匀混合成复合菌种发酵剂。
该棉粕复合菌种发酵剂的使用方法：将复合菌种发酵剂，以接种量5％、发酵温度35℃、发酵时间96h、料液比1∶1发酵条件进行棉粕固态发酵，发酵结束后，对其烘干、粉碎。
棉粕经复合发酵剂微生物发酵处理后，具有浓郁的酸香、酒香、酯香味，取实施例1、实施例2、实施例3及实施例4发酵后所得棉粕各一份，按如下方式进行测定：
游离棉酚的测定：按gb13086-91的测定方法。
蛋白质的测定：按gb/t6432-94饲料中粗蛋白的测定方法。
氨基酸含量的测定：按gb/t18246-2000的测定方法。
ph值：采用ph-25型酸度计测定。
结果如下表1：
表1
从表1可以看出，利用该发酵剂发酵棉粕后，游离棉酚的降解率≥70％，粗蛋白≥48％，氨基酸含量≥39％，消化吸收率≥88％，ph＜5.0，尤其是在产脘假丝酵母∶纳豆芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌按质量比为3∶0.5∶0.5复配时，游离棉酚降解率最高，粗蛋白含量和氨基酸含量处于同等情况下的高值范围，动物消化吸收率最高，ph值处于低值，更适合喂养动物。
在制备该发酵剂的过程中，采用四个步骤进行制备，保证各菌种均处于对数生长期，此时活菌数高、菌种活力强；采用甜菜副产品糖蜜作为碳源，和为棉花产地、甜菜产地的新疆等地区的实际情况相符，降低了生产成本，提高资源综合利用率。
依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明有了清楚的认识。
还需要说明的是，本文可提供包含特定值的参数的示范，但这些参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值。此外，除非特别描述或必须依序发生的步骤，上述步骤的顺序并无限制于以上所列，且可根据所需设计而变化或重新安排。并且上述实施例可基于设计及可靠度的考虑，彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用，即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。