一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法与流程

本发明涉及癌症医疗诊断技术领域，具体为一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法。

背景技术：

微小rna(mirna)是一类进化上保守内源性非蛋白质编码的rna分子，长约20至24个核苷酸，能够识别特定的目标信使rna(messagerrna,mrna)，并在转录后水平负调控基因。mirna通过切割或抑制特定mrna来负调控靶基因,广泛参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。如果mirna以肿瘤抑制基因或者癌基因为靶向，mirna的失常就能影响肿瘤形成。由于超过半数的mirna基因位于肿瘤相关基因组区域或脆弱位点，异常表达的mirna和多种肿瘤的发生，分期，转移和复发有着密切关系。

mir-21和mir-17-92家族被报道是与肿瘤关系最密切且具有癌基因功能的mirna，在包括肺癌、淋巴瘤等多种肿瘤的发生及发展过程中表达增强。研究表明，mir-21通过调节基因petn、pdcd4的抗凋亡活性，抑制肿瘤细胞的凋亡；将随着肿瘤恶性程度的增高，表达增强。同样，mir-17-92家族在肺癌中的高表达尤其是sclc发展过程中起着十分重要的作用。mir-17-92家族在肺癌早期表达升高，但是随着肺癌的发展，其表达下降；并且通过抑制mir-17-92家族的表达可以抑制肺癌的发展并诱导其凋亡。目前，研究发现mirna可作为一种新生物标志物，用于肿瘤的早期诊断和预后预测。但由于临床上缺乏成本低廉、操作简便的高通量mirna检测技术。使得这一新标记物诊断方法目前仅存在于“实验室阶段”。

pcr技术是目前最常用mirna检测技术，但是mirna的长度仅约22个核苷酸，通常在反转录时需要对mirna加尾或者进行引物的延伸处理，得到一个较长的反转录扩增因子，为pcr提供合适的模板。但是，目标mirna的超小尺寸导致要使用过短的寡核苷酸链引物，造成了解链温度(meltingtemperature,tm)的降低，影响了扩增的效率；其结果还可能会受mirna前体(mirnaprecursor,pre-mirna)的干扰。目前用于mirna检测的pcr技术主要为stem-loop茎环法和polya加尾法，这两种方法在检测原理上存在差异。stem-loop茎环法是先设计一种具有特殊的茎环结构反转录引物，在反转录过程中完成模板链的延长；而polya加尾法是对目标mirna采用多聚腺苷酸聚合酶在其末端加上一段polya尾，再采用常用的oligo(dt)反转录引物进行反转录，从而得到较长的模版链。这两种方法在检测特异性和检测通量上存在成本高、操作复杂等缺陷，阻碍了其临床应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法，检测结果准确可靠，操作简便易行，具有成本低、高通量、无需进行核酸提取与扩增等优点，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法，包括以下步骤：

s1：提取mirna，使用proteinasek消化血清中与mirna结合的蛋白质，并通过tween20表面活性剂破坏细胞外囊泡的脂质双层膜，使血清中的mirna游离出来；

s2：提取核酸探针，将与目标mirna互补配对的长段核酸探针分为两个部分，即两个短核苷酸链探针，分别为核酸探针1和核酸探针2；

s3：在马来酸酐化96孔酶标板上通过酰胺反应连接一段dna捕获序列，并加入处理后的血清样品、核酸探针1和核酸探针2，使两个短核苷酸链探针分别与目标mirna序列中的一半互补配对；

s4：通过核酸杂交将核酸探针1、血清中的目标mirna及核酸探针2固定在酶标板上；

s5：通过反复冲洗酶标板，去除错配和部分互补的mirna，进一步提高其检测体系的特异性；

s6：将s5中冲洗后的酶标板上的序列与biotin标记的信号放大序列杂交，用sa-hrp与信号放大序列上的biotin标记结合，并加入化学发光底物溶液；

s7：根据荧光强度确定血清中目标mirna的表达量，从而检测出目标mirna。

优选的，所述目标mirna序列为长度22个的碱基，其一半即11个碱基与一个短核苷酸链探针配对杂交出现错配和部分互补，产生较弱的结合方式。

优选的，所述dna捕获序列和信号放大序列设计参照luminex液相芯片的tag序列设计，其通过核酸杂交把核酸探针固定，并且序列与序列及序列与生物样本中的核酸成分之间由blast程序比对验证，不会发生核酸杂交。

优选的，所述mirna分为mir-16和mir-21，mir-16为一种在血液中表达较为恒定的mirna标志物，其作为血清mirna表达变化的内参物质；mir-21为一种普遍在癌症患者血液中高表达的mirna标志物，其作为非小细胞肺癌患者血清中的生物标志物。

优选的，所述方法检测mirna的线性范围在10fm至50pm之间，最低能检测1.248fm浓度的mirna。

优选的，所述s7中的荧光强度来源于化学发光底物溶液与结合到核酸探针上的辣根过氧化物酶产生的酶促反应，通过荧光强度进一步放大检测信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法，相比目前临床上使用的检测方法具有高灵敏性和特异性，通过人血清mirna检测筛查早期肺癌，特异性可达到90-100％，灵敏性可达到60-100％，将成为一种无创的肿瘤早期筛查和诊断新生物标志，对肺癌血清中几种mirna实现同步检测，可解决体检和临床诊断一次性多指标检测的需求，其检测结果准确可靠，操作简便易行，具有成本低、高通量、无需进行核酸提取与扩增等优点。

附图说明

图1为本发明sol技术原理图；

图2为本发明应用sol技术检测血清mirna的原理图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-2，本发明实施例中：一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法，包括以下步骤：

第一步：提取mirna，使用proteinasek消化血清中与mirna结合的蛋白质，并通过tween20表面活性剂破坏细胞外囊泡的脂质双层膜，使血清中的mirna游离出来；mirna分为mir-16和mir-21，mir-16为一种在血液中表达较为恒定的mirna标志物，其作为血清mirna表达变化的内参物质；mir-21为一种普遍在癌症患者血液中高表达的mirna标志物，其作为非小细胞肺癌患者血清中的生物标志物；

第二步：提取核酸探针，将与目标mirna互补配对的长段核酸探针分为两个部分，即两个短核苷酸链探针，分别为核酸探针1和核酸探针2；

第三步：在马来酸酐化96孔酶标板上通过酰胺反应连接一段dna捕获序列，并加入处理后的血清样品、核酸探针1和核酸探针2，使两个短核苷酸链探针分别与目标mirna序列中的一半互补配对；dna捕获序列和信号放大序列设计参照luminex液相芯片的tag序列设计，其通过核酸杂交把核酸探针固定，并且序列与序列及序列与生物样本中的核酸成分之间由blast程序比对验证，不会发生核酸杂交；目标mirna序列为长度22个的碱基，其一半即11个碱基与一个短核苷酸链探针配对杂交出现错配和部分互补，目标mirna与探针之间的结合作用就会进一步降低，产生较弱的结合方式，以便后续工序的冲洗；

第四步：通过核酸杂交将核酸探针1、血清中的目标mirna及核酸探针2固定在酶标板上；

第五步：通过反复冲洗酶标板，去除错配和部分互补的mirna，进一步提高其检测体系的特异性；

第六步：将s5中冲洗后的酶标板上的序列与biotin标记的信号放大序列杂交，用sa-hrp与信号放大序列上的biotin标记结合，并加入化学发光底物溶液；

第七步：根据荧光强度确定血清中目标mirna的表达量，从而检测出目标mirna；其荧光强度来源于化学发光底物溶液与结合到核酸探针上的辣根过氧化物酶产生的酶促反应，通过荧光强度进一步放大检测信号，该方法检测mirna的线性范围在10fm至50pm之间，最低能检测1.248fm浓度的mirna。

具体实施例一：

一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法，基于高通量sol检测血清mirna技术的建立及其优化：将血清样本经过前处理，通过与捕获序列、核酸探针1、核酸探针2、信号放大序列杂交，然后用sa-hrp催化化学发光底物溶液产生强烈的荧光，通过检测荧光强度确定血清中目标mirna的表达量；系统性优化血清处理时间、核酸杂交温度、信号放大序列上的biotin个数等条件，建立了一种特异性强、结果准确可靠、操作简便易行的mirna检测新方法，其检测线性范围在10fm至50pm之间，最低能检测1.248fm浓度的mirna；同时，应用这种mirna检测方法检测了20例健康对照者与34例nsclc患者血清样本中的mir-16与mir-21，发现nsclc患者血清中的mir-21表达量比健康对照者的高，趋势与荧光定量pcr法的检测结果相似；证明新开发的mirna检测新方法有潜力作为一种nsclc的诊断新工具。

具体实施例二：

一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清mirna的方法，应用sol技术检测血清中特异性mirna标志物进行肺癌早期诊断：利用sol检测新方法与已摸索好的血清前处理手段相结合，检测了来自临床的20例健康对照者与34例不同分期、年龄与性别的nsclc患者血清样本中的mir-16、mir-21这两种mirna；其中根据已有文献的报道，将在血液中表达较为稳定的mir-16作为内参物质，将在nsclc患者血清中特异性高表达的mir-21作为mirna标志物，同时，采用appliedbiosystems公司的taqmanmicrorna检测试剂盒与实时荧光定量pcr仪(7500)通过荧光定量pcr的方法检测了所收集到的血清样本中mir-16与mir-21，mir-21检测的ct值用内参mir-16的ct值进行均一化，mir-21相对于内参mir-16的倍数用2-δct表示，参阅表1-2。

表1荧光定量pcr检测健康对照者和nsclc患者血清中mirnas的ct值及其均一化后的表达倍数

δct*为检测血清中mir-21的ct值减去血清中mir-16的ct值；ad:adenocarcinoma，sc:squamouscarcinoma

表2应用sol技术的化学发光方法检测健康对照者和nsclc患者血清中mirnas的化学发光检测值(c.i.)及其均一化后的表达倍数

c.i.*21/16为mir-21化学发光检测值与内参mir-16化学发光检测值的比值；ad:adenocarcinoma，sc:squamouscarcinoma

由以上统计的检测数据可知，与健康对照者相比，nsclc患者血清中mir-21表达普遍升高，结果符合已有的文献报道，由荧光定量pcr技术检测结果可知(表1)，健康对照者血清中mir-21与内参mir-16均一化后的表达倍数一般在0.0174至0.1398，其中位数为0.0325；然而nsclc患者血清中mir-21与内参mir-16均一化后的表达倍数在0.0179至0.1857，其中位数为0.0709；由应用sol技术的化学发光检测方法结果可知(表2)，健康对照者血清中mir-21检测值与内参mir-16检测值比值倍数一般在0.0254至0.1376，其中位数为0.0434；然而nsclc患者血清中mir-21与内参mir-16均一化后的表达倍数在0.0217至0.2040，其中位数为0.0946，应用sol技术的化学发光检测方法结果与荧光定量pcr技术的检测结果较为一致，其中存在的差异可能来自于血清中mirna的分离过程。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。