一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用与流程

本发明属于酶的固定技术领域，具体涉及一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用。

背景技术：

甘油磷脂酰胆碱是由磷脂酰胆碱经过水解作用而生成的。由于甘油磷脂酰胆碱是一类重要的胆碱类化合物，它不仅可以用作生物合成磷脂酰胆碱的前体，也是人体内合成神经递质乙酰胆碱的前体，在治疗阿兹海默老年痴呆症等疾病中拥有潜在的应用价值。单用磷脂酶a1催化磷脂酰胆碱水解生成甘油磷脂酰胆碱，需要经历一步酰基转移，从sn-2-lpc转移生成sn-1-lpc。这种酰基转移发生的原因是sn-1-lpc的热力学稳定性要比sn-2-lpc低。酰基转移从sn-2-lpc到sn-1-lpc在反应中会一直进行，直到反应达到动态平衡。反应介质中缓冲溶液的浓度对于酰基转移作用并没有重大改变。但是，酸性条件和碱性条件可以加快酰基转移的进行，其中碱性环境更有利于酰基转移以及水解的过程。

表面活性剂不仅能够降低有机/水两相体系的界面张力，还能够影响酶分子的构象，在一定程度上能够提高酶分子的稳定性。然而，游离酶在含有表面活性剂的溶剂中通常只能使用一次，限制了其用途。虽然酶可以与金属离子以及表面活性剂通过共沉淀作用形成纳米复合物。但是随着在有机/水两相体系中催化反应长时间的进行，酶-表面活性剂纳米复合物仍然不能够保持较高的活力与稳定性。需要对酶-表面活性剂纳米复合物进行改性来提升其在有机/水两相体系中的催化性能。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种2-甲基咪唑修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用，该方法采用水相溶液混合法制备，操作简单、周期短、条件温和、成本低廉、酶稳定性高、酶回收率高、载体酶分子结合强度高，兼备生物和物理催化活性。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，表面活性剂改性游离酶

配0.01-1mmol/ml表面活性剂水溶液，室温下，边搅拌边滴加游离酶液至澄清，得混合液；

步骤2，制备金属离子/表面活性剂-酶纳米复合催化剂

向混合液中边搅拌变滴加0.01-1mmol/ml金属离子盐溶液，室温下搅拌30-60min后得金属离子/表面活性剂-酶纳米复合催化剂的水溶液；

步骤3，制备咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂

向步骤2的水溶液中加入0.01-1mmol/ml咪唑及其衍生物水溶液，搅拌20-40min，离心并用去离子水冲洗1-3次，真空冷冻干燥至恒重即可。

作为改进的是，所述表面活性剂为脱氧胆酸钠，牛磺脱氧胆酸钠，甘氨脱氧胆酸纳，鹅脱氧胆酸钠中的一种，游离酶液的溶质为磷脂酶a1。

作为改进的是，步骤1中表面活性剂的浓度为10mmol/l，搅拌速度为100～150rpm。

作为改进的是，步骤2中所述金属离子为co²⁺、ca²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ba²⁺、cu²⁺、ni²⁺、sn²⁺、mg²⁺中任一种，浓度为20mmol/l，搅拌速度为100～150rpm。

作为改进的是，步骤3中所述咪唑及其衍生物为2-甲基咪唑。

进一步改进的是，步骤3中咪唑及其衍生物水溶液的浓度为50mmol/l，离心速度为7000rpm，离心时间为15min，真空冷冻干燥的真空度为1.3～13pa，温度为-85℃～-10℃。

上述咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂在水油两相生物催化中的应用。

作为改进的是，上述应用包括以下步骤：称取含磷脂酰胆碱的原料于离心管中，加入去离子水和有机溶剂，再加入咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂，在水浴锅中搅拌反应一段时间后得到产物甘油磷脂酰胆碱。

本发明反应机理为：

与现有技术相比，本发明制备方法操作简单、周期短、成本低廉、反应条件温和、载体酶分子结合强度高。本发明一种利用咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂以沉淀的形式生成，提高了纳米复合催化剂中酶的稳定性和活性，同时兼具生物和物理催化活性，尤其适合用于水相催化、有机相催化、两相催化反应领域。

附图说明

图1为实施例1所得一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的扫描电镜图，其中，a为磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物,b为咪唑及其衍生物修饰的磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物

图2为实施例1咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的投射电镜图，a为磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物，b为咪唑及其衍生物修饰的磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物；

图3为咪唑及其衍生物修饰的表面活性剂纳米复合物与咪唑及其衍生物修饰的磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物的傅里叶红外图谱；

图4为咪唑及其衍生物修饰的表面活性剂纳米复合物与咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的热重分析；

图5为咪唑及其衍生物修饰的表面活性剂纳米复合物、咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂、游离磷脂酶a1的催化效率对比图；

图6咪唑及其衍生物修饰的磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物的重复利用率图。

具体实施方式

下面结合发明和附图详细说明本发明的优选技术方案。

实施例1

一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，表面活性剂改性游离酶

配10mmol/ml表面活性剂水溶液，室温下，边搅拌边滴加游离酶液至澄清，得混合液，其中，搅拌速度为100rpm；

步骤2，制备金属离子/表面活性剂-酶纳米复合催化剂（hmim@msnc）

向混合液中边搅拌变滴加20mmol/l的氯化钴溶液，室温下搅拌30min后得金属离子/表面活性剂-酶纳米复合催化剂的水溶液，其中，搅拌速度为120rpm。

步骤3，制备咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂（hmim@pla1-msnc）

向步骤2的水溶液中加入50mmol/l的咪唑及其衍生物水溶液，搅拌30min，离心并用去离子水冲洗3次，真空冷冻干燥至恒重即可，其中离心速度为7000rpm，离心时间为15min，真空冷冻干燥的真空度为1.3pa，温度为-85℃。

本实施例制备的咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂（hmim@pla1-msnc）在电镜下的扫描图如图1所示，从图中可以看出，磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物（pla1-msnc）的粒径在100nm以下，而咪唑及其衍生物修饰的磷脂酶a1表面活性剂纳米复合物（hmim@pla1-msnc）的粒径在200nm以下，这是由于咪唑及其衍生物能够与材料制备过程中溶液的钴离子反应，在msnc或pla1-msnc的表面生成了晶体，而这些晶体又能够将多个msnc纳米颗粒或pla1-msnc纳米颗粒交联在一起。与msnc和hmim@msnc相比，pla1-msnc和hmim@pla1-msnc的形貌有所改变，这是由于在固定化酶制备的过程中pla1对载体结构所影响的。

为了进一步验证pla1是否成功包埋在hmim@msnc内部，测试了hmim@msnc、hmim@pla1-msnc的傅里叶红外图谱。如图2所示，hmim@pla1-msnc在1645cm^-1处出现了酰基c=o的振动峰，证明了pla1已经成功地被固定在hmim@msnc内部。

如图3所示，hmim@msnc在热解第二阶段，其重量下降了61.93%，而hmin@pla1-msnc下降了65.07%，同样证明了pla1已经成功地被固定在hmim@msnc内部。

本实施例中咪唑及其衍生物为2-甲基咪唑。

实施例2

用实施例1所得的咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂在油水两相中应用，用于催化合成甘油磷脂酰胆碱的研究。

该应用包括以下步骤：称取1.5g的蛋黄卵磷脂（含有70%的磷脂酰胆碱）装入10ml的塑料管内，加入2.5ml的去离子水与2.5ml的有机溶剂，最后加入100μl的游离pla1或者含有相等酶蛋白含量的hmim@pla1/msnc（15mg）。在40°c的水浴锅中磁力搅拌（600rpm）30min，使用高效液相色谱测定甘油磷脂酰胆碱的产量。

取反应液200μl溶于1ml的甲醇-正己醇混合液中（v:v=99:1），并使用0.22μm的尼龙膜过滤稀释液，以去除不溶物。滤液在氮气气氛中进行干燥并在hplc-elsd中进行分析测定。色谱柱为硅胶柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为甲醇和水溶液（v:v=90:10），流速为1.0ml/min，柱箱温度控制在25°c。

实施例3

实施例2中使用有机溶剂溶解蛋黄卵磷脂，其中有机溶剂分别为异辛烷、正庚烷、正己烷、正辛醇、丁醇、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。比较不同有机溶剂对pla1与hmim@pla1-msnc催化产量的影响，结果如表1所示。

反应30min时，游离pla1在所有有机溶剂中均不能催化磷脂酰胆碱生成甘油磷脂酰胆碱。而hmim@pla1-msnc可以催化磷脂酰胆碱在异辛烷、正庚烷、正己烷、正辛醇中分别生成341.02μmol/l、559.84μmol/l、919.96μmol/l、239.73μmol/l的甘油磷脂酰胆碱，而在丁醇、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中也不能催化生成甘油磷脂酰胆碱。随着有机溶剂极性的升高，甘油磷脂酰胆碱的产量呈现先增大后降低的趋势。这是因为当有机溶剂的极性较低时，虽然对酶活的损伤较小，但是对底物的溶解度较低，不利于hmim@pla1-msnc的催化反应。随着有机溶剂极性的升高，底物的溶解度也随之增大，但是极性较高的溶剂容易引起酶的失活。在这些有机溶剂中，底物磷脂酰胆碱能够很好地溶解于正己烷中，且正己烷对酶活的伤害较小，因此hmim@pla1-msnc在正己烷中催化磷脂酰胆碱生成甘油磷脂酰胆碱的产量最高。

实施例4

研究游离pla1与hmim@pla1-msnc催化效率的差异性，考察对比了pla1、pla1-msnc、pla1-msnc与咪唑及其衍生物、以及hmim@pla1-msnc催化磷脂酰胆碱生成甘油磷脂酰胆碱的产量。

如图5所示，反应30min后，游离pla1不能催化磷脂酰胆碱生成甘油磷脂酰胆碱的产量，原因可能是一方面反应体系为有机水两相，较大的界面张力对游离pla1的构象存在破坏作用，另一方面酰基转移作用需要的时间过长，导致没有甘油磷脂酰胆碱的生成。而当pla1固定在msnc中时，所生成的pla1-msnc具有表面活性剂的功能，能够减少有机水两相的界面张力，并且能够保持酶的稳定性。但是由于此时酰基转移作用仍需要一段时间，所以pla1-msnc催化生成的甘油磷脂酰胆碱产量只有203.86μmol/l。当添加2mg的2-甲基咪唑时，pla1-msnc催化生成的甘油磷脂酰胆碱产量达到521.27μmol/l，这是因为2-甲基咪唑使得反应液ph处于微碱性，而微碱性的环境有利于酰基转移作用。在制备纳米催化剂过程中，使用2-甲基咪唑修饰pla1-msnc可能使hmim@pla1-msnc成为微碱性的催化剂，且使得其中的pla1的构象更加稳定。在反应30min后,hmim@pla1-msnc催化生成的甘油磷脂酰胆碱产量可以达到919.96μmol/l。

本发咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂方法简单，催化生产甘油磷脂酰胆碱产量可达到919.96μmol/l，且该固定化酶在正己烷中催化磷脂酰胆碱生成甘油磷脂酰胆碱的产量最高。

在实际的生产过程中，固定化酶不仅要节约成本、缩短反应时间，还要满足可以多次重复利用的需求。图6考察了hmim@pla1-msnc在上述反应条件中重复利用的情况。如图6所示：经过10次的重复利用后，hmim@pla1-msnc的酶活只下降了60%，表明在这种反应体系中hmim@pla1-msnc拥有良好的重复利用性能。