本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种优化的rna高通量测序文库构建的方法及其应用。
背景技术：
以illumina测序平台为代表的下一代测序（next-generationsequencing，ngs）目前已经在dna测序领域、rna测序领域等具有广泛的应用。rna-seq可以把mrna、小rna、非编码rna、rna病毒等的rna序列利用高通量测序技术一次实验测序获得。
通常构建rna测序文库一般包括以下步骤：将rna片段采用机械法或酶法打断到一定长度、纯化打断的rna、利用随机引物进行反转录、合成cdna二链、末端修复和加a加接头、纯化、indexpcr扩增和indexpcr产物纯化。这样的建库方法包括三次繁琐的纯化步骤，对实验试剂、耗材、时间和人力造成了很大的浪费。同时，建库过程中需要采用随机引物，随机引物有时会带来反转录的不平衡，给测序结果带来一定偏差。
为了消除rna测序文库过程中存在的随机引物影响，减少纯化步骤，本发明提出了采用片段化的rna直接连接接头，避免了随机引物的使用；将纯化步骤由三步减少到两步纯化，大量节约了人力物力，同时提高了rna文库构建的质量和效率。
技术实现要素：
第一方面本发明提供了一种优化的rna高通量测序文库构建的方法及其应用，所述的方法进行rna高通量文库构建消除了rna测序文库过程中存在的随机引物影响，减少了纯化步骤，大量节约了人力物力，同时提高了rna文库构建的质量和效率。
为解决上述技术问题，本发明的具体实施方式提供了一种优化的rna高通量测序文库构建的方法，本方法采用以下技术方案。
本发明提供一种优化的rna高通量测序文库构建的方法，所述方法采用rnaseiii进行待测rna样本打断、采用rna连接酶连接接头、采用反转录酶和热启动高保真dna聚合酶体系进行一步法反转录和加标签pcr构建高通量测序文库。
本发明所述的待测rna样本可以为mrna样本、rrna样本、单链病毒rna样本、lncrna样本等各种类型的用于高通量测序文库构建的rna样本。
本发明采用rnaseiii对所述待测序rna样本进行打断，打断后的rna片段带有突出的5’端磷酸基团和3’端羟基基团，无需经过其他处理，纯化后即可直接用于接头连接。
本发明采用agencourtrnacleanxpbeads（beckmancoulter公司产品）对打断后的rna片段进行纯化，可以对打断后的rna片段进行高效回收纯化。
本发明采用t4rna连接酶i对纯化后的mrna片段进行加接头反应，t4rna连接酶i可以高效的连接单链rna接头的3’末端羟基基团和纯化后的mrna片段5’末端磷酸基团，同时，t4rna连接酶i可以高效的连接单链dna接头的5’末端磷酸基团和纯化后的mrna片段的3’末端羟基基团。连接反应后，纯化后的mrna片段5’端连入人工合成的单链rna接头，3’端连入人工合成的单链dna接头。
本发明提供的单链rna接头和单链dna接头序列为但不局限于illumina测序平台通用接头序列，illumina测序平台接头序列如下面no.1和no.2所示：
no.1:5’-acacucuuucccuacacgacgcucuuccgaucu-3’
no.2:5’-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3’。
本发明采用一步法反转录和cdnaindexpcr，所述反转录反应采用多点突变改造的反转录酶thermo-scriptrtase进行反转录，具有更好的延伸能力和稳定性；所述cdnaindexpcr反应采用热启动高保真dna聚合酶进行cdnaindexpcr，具有更好的保真性，反应产物纯化可以直接用于illumina测序平台进行测序。
本发明采用spriselect磁珠（beckmancoulter公司产品）对indexpcr产物进行片段筛选和纯化，spriselect磁珠可根据实验需要纯化目的大小的dna片段，用于后续测序反应。
第二方面，本发明提供一种优化的rna高通量测序文库构建的试剂盒，所述试剂盒第一方面所述的rnaseiii及其缓冲液、t4rna连接酶i及其反应缓冲液、单链dna和单链rna接头、反转录酶thermo-scriptrtase、热启动高保真dna聚合酶及其反应缓冲液和indexpcr引物。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的方法，或第二方面所述的优化的rna高通量测序文库构建的试剂盒，或第二方面所述的试剂盒在rna高通量测序文库制备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明采用对打断后的rna片段直接加接头，避免了在rna测序文库构建过程中使用随机引物，避免了随机引物引起的扩增不平衡的影响，提高了测序文库构建的质量；
（2）本发明提供的rna高通量测序文库构建的方法将纯化步骤由三步减少到两步纯化，大量节约了纯化试剂、纯化时间，节约了人工成本；
（3）本发明提供的rna高通量测序文库除可用于转录组文库构建、小rna文库构建、lncrna文库构建等外，还可以用于rna病毒基因组文库构建；
（4）本发明提供的rna高通量测序文库用于构建rna病毒基因组文库，可以得到更全面的rna病毒基因组信息，更全面了解rna病毒基因组遗传新消息；
（5）本发明提供的rna高通量测序文库可用于所有基于illumina测序平台的rna文库构建，更换接头和标签序列后还可用于其他测序平台如iontorrent测序平台。
附图说明
图1本方法构建的拟南芥mrna高通量测序文库用agilent2100质检的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
以下实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
1拟南芥叶片总rna的提取和mrna的纯化
1）拟南芥叶片总rna的提取采用trizol法，具体步骤参见《分子克隆》第三版；
2）拟南芥叶片mrna的纯化采用toyobo公司mrnapurificationkit纯化mrna，具体步骤参见产品说明书。
2拟南芥mrna片段化
1）取3-7μl拟南芥叶片mrna（总含量100-500ng）置于一个新的rnasefree的0.2mlep管，加入2μl5xrnaseiiireactionbuffer和1μlrnaseiii，加rnasefree的ddh2o至总体积10μl；
2）将步骤1）获得的混合物轻柔混匀后瞬时离心使液体存在于管底，37°c孵育10min。
3片段化mrna的纯化
1）向反应结束后的步骤2）的ep管迅速加入40μlddh2o和110μlagencourtrnacleanxpbeads（beckmancoulter公司产品）；
2）吹打混匀后，瞬时离心后室温孵育15min；
3）将步骤2）的ep管置于磁力架，静置5min；
4）弃上清，加入150μl80%乙醇，室温孵育1min；
5）将步骤4）的ep管置于磁力架，静置5min；
6）重复步骤4），5）；
7）弃上清，室温放置10min，晾干磁珠；
8）磁珠重悬于15μlrnasefree的ddh2o，混匀后瞬时离心，置于磁力架上静置5min；
9）转移上清至另一干净的rnasefree的的离心管。
4片段化的mrna加接头
加接头反应体系如下：
总体积20μl；
连接反应条件：上述样品混匀后，37°c孵育30min，65°c10min终止反应。
5一步法反转录和cdnaindexpcr
配置反应体系如下：
总体积50μl；
上述反应液混匀后，瞬时离心，采用下面的反应条件进行反应。
6pcr产物片段大小筛选和纯化
1）涡旋混匀spriselect磁珠（beckmancoulter公司产品）；
2）取50μlpcr产物加入30μl涡旋混匀的spriselect磁珠，轻柔混匀后瞬时离心，室温孵育5min；
3）置于磁力架上，静置5min后，转移上清至一个新的200μlep管，加入10μl，涡旋混匀的ampure磁珠，轻柔混匀后瞬时离心，室温孵育5min；
4）置于磁力架上，静置5min后，弃上清；
5）加入150μl80%乙醇，室温孵育1min；
6）将步骤5）的ep管置于磁力架，静置5min，弃上清；
7）重复步骤5），6）；
8）弃上清，室温放置10min，晾干磁珠；
9）磁珠重悬于25μlrnasefree的ddh2o，混匀后瞬时离心，置于磁力架上静置5min；
10）转移上清至另一干净的离心管，储存于-20°c冰箱备用，或直接用于文库质检和测序。
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<110>哈尔滨博泰生物科技有限公司
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