金离子检测及吸附系统及其宿主菌、金离子回收方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种金离子检测及吸附系统及其宿主菌、金离子回收方法。

背景技术：

金是人类较早发现和利用的贵金属，由于其资源稀少及特有的理化性质，自古以来被视为五金之首，有“金属之王”的称号。金是重金属中少有的化学、物理、电子性能优异的金属，具有较高的稳定性，它的应用领域非常广泛。由于金具备非常稳定的理化性质，如抗腐蚀性、导电性、导热性和稳定性，使它能够广泛用到许多现代高新技术当中去，金离子在免疫系统能够作为白细胞等免疫细胞的抑制剂。此外，金在生物学及医药学领域同样扮演重要的作用，如细菌抗性及抗癌药物研发等。

当今社会重金属对土壤、水、环境的污染问题越来越受到重视。重金属金的矿产资源被开发的同时，有一部分进入环境中，然后通过地大气、地表水、地下水和生物链直至大气圈等传播途径，对人民的生产生活以及生态系统产生污染、破坏乃至威胁到人们的生存环境及生命健康。此外，在不合理的开采和黄金的冶炼及二次加工等生产过程中产生一些副产物，这些问题已经严重影响到黄金产业的发展。众所周知，黄金的含量是十分有限的，属于稀有的贵金属资源，如果我们能够合理地开发金矿产资源，减少资源的浪费，可以很大程度上提高金矿产资源的有效利用率。所以，能够对环境中的金离子的检测，以及能够合理的回收环境中的金离子十分重要。随着金应用范围的不断扩大，尤其是金在食品安全方面以及医药健康的使用，从而致使许多金离子通过食物链的富集作用进入到动植物体内，能使蛋白质变性引起环境以及人的健康危害。由于金离子在环境中不能被分解，还能够在水中的其他的有毒物质结合生成毒性更大的产物，这些有毒产物通过动植物吸收，对消化系统、免疫系统造成严重破坏。金离子还能够在人体内与各种酶发生的结合形成复合物，使酶本身失去活性，进而使人的身体机能遭到破坏，危害人体的健康，严重时甚至威胁生命。特别三价金离子能够与生物体内发生作用，导致生物体中毒，影响生物体的健康。所以重金属金离子的检测和回收逐渐为社会所关注，寻找准确、灵敏、快速的金检测方法在当今科学界具有非常重要的意义，如何检测和回收环境中的金离子成为当今时代的热点问题。

现有的重金属离子回收方法主要是化学方法，通过加入化学试剂与重金属离子形成沉淀或者悬浮达到回收重金属的目的。但是化学方法有三个缺点：第一是化学方法有可能由于加入的化学试剂的量不合适而造成二次污染；第二是化学方法选择性不够高，尤其是处理性质极相近的各种重金属效果不好，即使回收得到了一定的目的金属，纯度也不高，还需要进一步处理；第三是化学方法回收工业废水中的重金属，所产生污水对于环境不友好，沉淀剂等化学试剂可能对于自然环境造成更大的破坏。因此，现有的方法很难实现对工业废水中金离子的高效选择性检测及富集和回收。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种金离子检测及吸附系统及其宿主菌、金离子回收方法，旨在解决现有金离子回收纯度低、效果不理想，以及污染环境的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种金离子检测及吸附系统，包括检测单元和与所述检测单元连接的吸附单元，所述检测单元包括荧光蛋白dna序列，且所述荧光蛋白dna序列与第一启动子连接；所述吸附单元包括互相连接的大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列和金离子结合蛋白golbdna序列，且所述大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列与第二启动子连接；所述检测单元位于所述吸附单元的上游。

另一方面，本发明提供一种金离子检测及吸附蛋白表面展示系统，包括由上述金离子检测及吸附系统表达的荧光蛋白、大肠杆菌外膜蛋白ompa和金离子结合蛋白golb。

另一方面，本发明提供一种表达载体，包括上述金离子检测及吸附系统。

又一方面，本发明提供一种宿主菌，所述宿主菌包括上述表达载体或所述宿主菌表达上述金离子检测及吸附蛋白表面展示系统。

再一方面，本发明提供一种上述金离子检测及吸附系统的制备方法，包括如下步骤：

从大肠杆菌基因组中扩增出大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列，从鼠伤寒沙门氏菌基因组dna中扩增出金离子结合蛋白golbdna序列；

以所述大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列和所述金离子结合蛋白golbdna序列为模板，扩增出ompa-golb融合蛋白dna序列；

从大肠杆菌表达载体基因组中扩增荧光蛋白dna序列；

将第一启动子、所述荧光蛋白dna序列、第二启动子、所述ompa-golb融合蛋白dna序列依次连接。

最后，本发明提供一种金离子回收方法，包括如下步骤：

提供含有金离子的液体；

将权利要求6所述的宿主菌培养后加入所述液体中，静置处理；

待所述溶液中出现沉淀后，进行过滤处理得到吸附有金离子的所述宿主菌；

用酸处理吸附有金离子的所述宿主菌，分离后得到金离子。

本发明的金离子检测及吸附系统基于鼠伤寒沙门氏菌中金离子的调控机制设计，其中包含了检测单元和吸附单元，检测单元包括报告荧光蛋白dna序列，其可以可视化检测金离子，而吸附单元包括ompa-golb吸附部分，高效吸附金离子。将该系统连接到质粒中后导入非致病性的大肠杆菌细胞体内，在启动子调控下可视化检测和吸附金离子，因此该种经过改造后的工程菌对金离子的检测及吸附具有很好的效果；因报告荧光蛋白、大肠杆菌外膜蛋白ompa和金离子结合蛋白golb的高效表达，其工程菌可以表达金离子检测及吸附蛋白表面展示系统，因此金离子检测及吸附系统容易制备、成本较低、操作方便。

本发明提供的金离子回收方法，可以集金离子检测及吸附一体化，用本发明的工程菌对含金工业废水的处理：将工程菌液加入到废水中，菌体能够在检测到含金废水的同时在细胞膜外大量表达golb蛋白，将废水中的金离子结合。在完成金离子的结合吸附后，对菌体进行聚集和沉淀，菌体回收方便。通过对菌体的处理和二次使用，本发明最终能够通过生物手段实现对工业废水中重金属金的检测及可循环富集和回收；因此，本发明能够克服现有技术的缺点，不会造成二次污染，对环境友好。

附图说明

图1是本发明实施例1金离子检测系统质粒构建图谱；

图2是本发明实施例1金离子检测系统质粒的电泳鉴定图；其中，m是dna分子量标准，1是金离子检测系统质粒泳道；

图3是本发明实施例2金离子吸附系统质粒构建图谱；

图4是本发明实施例2金离子吸附系统质粒的电泳鉴定图；其中，m是dna分子量标准，1是融合蛋白表达lpp-ompa-golb质粒泳道；

图5是本发明实施例3金离子检测及吸附系统质粒构建图谱；

图6是本发明实施例5水体中金离子敏感性检测效果示意图；

图7(a)是本发明实施例6水体中金离子选择性检测效果示意图；

图7(b)是本发明实施例5水体中金离子选择性检测效果示意图；

图8是本发明实施例7蛋白表达验证图；

图9是本发明实施例5水体中金离子的浓度和诱导时间对检测的影响；

图10是本发明实施例8金离子吸附能力效果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种金离子检测及吸附系统，包括检测单元和与该检测单元连接的吸附单元，检测单元包括荧光蛋白dna序列，且该荧光蛋白dna序列与第一启动子连接；吸附单元包括互相连接的大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列和金离子结合蛋白golbdna序列，且大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列与第二启动子连接；该检测单元位于吸附单元的上游。

在一实施例中，第一启动子为pgols-gols-pgolb，其序列如seqidno:10所示；第二启动子为pgolb，其序列如seqidno:19所示。大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列如seqidno:3所示，金离子结合蛋白golbdna序列如seqidno:6所示。

具体地，荧光蛋白是一种发光、可视化的蛋白，可为红色荧光蛋白rfp或绿色荧光蛋白egfp，在本实施例中主要起对金离子可视化检测报告作用，在本发明一优选的实施例中，荧光蛋白为红色荧光蛋白rfp，其dna序列如seqidno:13所示。

在本发明一优选实施例的金离子检测及吸附系统中，第二启动子与大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列之间还连接有脂蛋白lppdna序列，脂蛋白lppdna序列如seqidno:22所示。在该条件下，该系统表达的lpp蛋白可以增强大肠杆菌外膜蛋白ompa的表面展示能力，从而使金离子结合蛋白golb在细胞膜上结合更稳固更紧密。

另一方面，本发明实施例提供一种金离子检测及吸附蛋白表面展示系统，其包括本发明实施例的金离子检测及吸附系统表达的荧光蛋白、大肠杆菌外膜蛋白ompa和金离子结合蛋白golb；或包括本发明另一实施例的金离子检测及吸附系统表达的荧光蛋白、脂蛋白lpp、大肠杆菌外膜蛋白ompa和金离子结合蛋白golb。

另一方面，本发明实施例提供了一种表达载体，该表达载体包括本实施例的金离子检测及吸附系统。同时，本发明实施例提供了一种宿主菌，该宿主菌包括本实施例的表达载体；或表达本实施例的金离子检测及吸附蛋白表面展示系统。

又一方面，本发明实施例提供一种上述金离子检测及吸附系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

s011：从大肠杆菌基因组中扩增出大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列，从鼠伤寒沙门氏菌基因组dna中扩增出金离子结合蛋白golbdna序列；

s012：以上述大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列和金离子结合蛋白golbdna序列为模板，扩增出ompa-golb融合蛋白的dna序列；

s013：从大肠杆菌表达载体基因组中扩增荧光蛋白dna序列；

s014：将第一启动子、所述荧光蛋白dna序列、第二启动子、所述ompa-golb融合蛋白dna序列依次连接。

在一实施例中，扩增大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；扩增金离子结合蛋白golbdna序列的引物seqidno:4、seqidno:5所示。

而根据具体荧光蛋白不同，选择的扩增引物也不同，本实施例的荧光蛋白dna序列为红色荧光蛋白rfpdna序列，其可以从本实验室的大肠杆菌表达载体基因组中扩增红色荧光蛋白rfpdna序列，且扩增引物如seqidno:11、seqidno:12所示。而在一实施例中，第一启动子为pgols-gols-pgolb，且其扩增引物如seqidno:8、seqidno:9所示，第二启动子为pgolb，且其扩增引物如seqidno:17、seqidno:18所示，两种启动子都可以从从鼠伤寒沙门氏菌基因组扩增得到，而本实施例的pgolb优选从本实验室的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中扩增，效率更高。

又一实施例中，通过从表达脂蛋白lpp的菌种中扩增出脂蛋白lpp的dna序列，连接在第二启动子pgolb与大肠杆菌外膜蛋白ompadna序列之间，使金离子结合蛋白golb在细胞膜上结合更稳固更紧密。

最后，本发明实施例提供一种金离子回收方法，包括如下步骤：

s021：提供含有金离子的液体；

s022：将本发明实施例的宿主菌培养后加入到上述液体中，静置处理；

s023：待溶液中出现沉淀后，进行过滤处理得到吸附有金离子的宿主菌；

s024：用酸处理吸附有金离子的宿主菌，分离后得到金离子。

在一优选实施例中，上述步骤s021中，含有金离子的液体可以是各种工业废水、矿业废水等中含有金离子回收液，在该液体中金离子的浓度范围为0.01μm～20μm；本实施例提供宿主菌在金离子浓度为0.01μm时就有很好的检测效果，且在金离子浓度为10μm时检测效果最佳。上述步骤s022中，静置处理的时间范围为10h～15h，该范围内宿主菌对液体中金离子的吸附效果达到最佳。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1金离子检测系统表达质粒的构建及鉴定

1.检测系统中金离子诱导基因pgols-gols-pgolb片段的扩增

使用特异引物pgolts1(seqidno:8)和pgolts2(seqidno:9)从鼠伤寒沙门氏菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中扩增出编码金诱导基因的dna序列(seqidno:10)；本实施例的金离子诱导基因(goldinductivegene)即为启动子pgols-gols-pgolb，其可以表达gols蛋白，gols蛋白平时起到阻遏作用，在有金离子存在时才会从启动子pgolb的dna序列上脱落，引发下游基因表达。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：95℃，3分钟

第二步：95℃，1分钟

第三步：60℃，2分钟

第四步：72℃，4分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

2.检测系统中报告基因rfp-terminator片段的扩增

1)红色荧光蛋白rfp片段基因的扩增

使用特异引物rfp1(seqidno:11)和rfp2(seqidno:12)从本实验室的大肠杆菌表达载体基因组dna中扩增出编码红色荧光蛋白rfp的dna序列(seqidno:13)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，1分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃。10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

2)终止子terminator片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，从本实验室所有的大肠杆菌表达载体基因组dna中扩增出终止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

3)rfp-terminator片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，使用特异引物rfp1(seqidno:11)和term2(seqidno:15)，以上述第1和2点回收的扩增产物为模版，扩增出rfp-terminator片段的dna序列，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：65℃，0.5分钟

第四步：72℃，1分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

3.检测系统中金离子诱导基因和报告基因融合蛋白表达质粒的构建与鉴定

1)使用dna限制性内切酶ecori和psti酶切上述金离子诱导基因：启动子pgols-gols-pgolb扩增得到的dna片段(seqidno:10)，然后使用t4dna连接酶插入到本实验室所有的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃，水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)：

反应条件：16℃，水浴16小时。

2)使用dna限制性内切酶xbai和psti酶切上述rfp-terminator的扩增dna片段，然后使用t4dna连接酶插入1)步骤构建完成的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃，水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)：

反应条件：16℃，水浴16小时。

3)检测系统中金离子诱导基因和报告基因融合蛋白表达质粒的提取结果请见图1(图中golb启动子即为启动子pgols-gols-pgolb)，电泳鉴定结果请见图2。

实施例2金离子吸附系统表达质粒的构建及鉴定

1.吸附系统中金离子诱导基因pgolb片段的扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物pgolb1(seqidno:17)和pgolb2(seqidno:18)，从本实验室所有的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中扩增出金离子调控基因的启动子的pgolbdna序列(seqidno:19)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：95℃，2分钟

第二步：95℃，0.5分钟

第三步：63℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

2.吸附系统中金离子吸附基因片段的扩增

1)大肠杆菌外膜蛋白a(ompa)片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物ompa1(seqidno:1)和ompa2(seqidno:2)，从大肠杆菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_000913)中扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白a(ompa)第1位至第159位氨基酸的dna序列(seqidno:3)。

反应条件如下：

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：95℃，2分钟

第二步：95℃，0.5分钟

第三步：63℃，0.5分钟

第四步：72℃0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

2)金离子结合蛋白golb片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物golb1(seqidno:4)和golb2(seqidno:5)从鼠伤寒沙门氏菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中扩增出编码金离子结合蛋白golb的dna序列(seqidno:6)，并在其c端加上编码flag-tag的序列，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：95℃，2分钟

第二步：95℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

3)终止子terminator片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，从本实验室所有的大肠杆菌表达载体基因组dna中扩增出终止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

3.lpp-ompa-golb融合蛋白表达质粒的构建及鉴定

1)设计特异引物l1(seqidno:20)和l2(seqidno:21)，从表达脂蛋白lpp的大肠杆菌中扩增出脂蛋白lppdna(seqidno:22)产物，使用dna限制性内切酶xbai和psti酶解该脂蛋白lpp片段以及上述pgolb片段、ompa片段、golb片段、terminator片段的扩增产物，然后使用t4dna连接酶插入大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中，lpp-ompa-golb融合蛋白表达质粒构建图谱请详见图3；其中ompa-golb融合蛋白的dna序列为：seqidno:7。。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)：

反应条件：16℃水浴16小时。

2)lpp-ompa-golb融合蛋白表达质粒的提取与鉴定，结果请见图4。

实施例3金离子检测及吸附系统表达质粒的构建及鉴定

1.使用dna限制性内切酶psti和spei酶解上述实施例1中得到的pgols-gols-pgolb-rfp-terminator酶解片段，使其具有粘性末端，使用dna限制性内切酶psti和xbai酶解上述实施例2中得到的pgolb-lpp-ompa-golb-terminator酶解片段，使其具有粘性末端然后使用t4dna连接酶插入到大肠杆菌生物砖质粒骨架pzh2中。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)：

反应条件：16℃水浴16小时。

2.金离子检测及吸附一体化表达质粒的提取结果请见图5。

实施例4金离子检测及吸附系统质粒转入宿主菌

1)将上述实施例4得到的重组质粒pzh2通过化学转化方法导入大肠杆菌细胞dh5α中，通过在含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb固体培养基上于37℃中培养16小时，从中筛选出阳性克隆并加以保存。

感受态细胞的热激转化和稀释涂布步骤如下：将连接反应的产物于感受态细胞(dh5α)中，手指轻弹混匀；冰浴30分钟后42℃热激95秒，快速转移至冰上；冰浴2分钟后每管加入事先37℃预热好的lb培养基900μl，37℃，200rpm培养1小时使其复苏；3000rpm离心30秒，移去0.9ml上清后，取下层0.1ml涂布相应的抗性平板，37℃培养10小时。

2)重组菌的筛选和鉴定

采用常规菌落pcr法和抽提阳性克隆的质粒后酶切鉴定法，具体可参见《takara限制性内切酶采购目录和技术指南》。测序由上海生物工程技术服务公司完成，金离子检测及吸附系统质粒的提取与鉴定。

实施例5金离子检测及吸附系统检测金离子能力的测试

1.金离子的浓度对检测的影响

1)将用于检测金离子的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb液体培养基中于37℃中培养过夜；将过夜培养菌液1:100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)lb液体培养基中于37℃中培养至培养液od600＝0.6，向培养液中加入终浓度为0；0.001；0.01；0.1；0.25；0.5；1；5；10；20μm的金离子，培养液在37℃中继续培养过夜；

2)培养10h的细菌培养液通过离心(8000转/分钟，2min)收集后，用去离子水清洗1次；

3)清洗后的菌体使用1×pbs缓冲液重悬；

4)使用酶标仪检测重悬后的菌液。

5)具体检测结果请见图6，经改造的工程菌在金离子浓度为0.01μm时就有很好的检测效果，且在金离子浓度为10μm时检测效果最好。

2.金离子的浓度和诱导时间对检测的影响

1)将用于检测金离子的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb液体培养基中于37℃中培养过夜；将过夜培养菌液1:100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)lb液体培养基中于37℃中培养至培养液od600＝0.6，设置四个不同的浓度梯度，在四个不同的浓度梯度下设置不同的时间梯度。四个不同的金浓度梯度，分别为0.1、1、5、20μmol，时间梯度分别为0.5、1、1.5、2、3、5、7.5、10h。培养10h。

2)培养10h的细菌培养液通过离心(8000转/分钟，2min)收集后，用去离子水清洗1次；

3)清洗后的菌体使用1×pbs缓冲液重悬；

4)使用酶标仪检测重悬后的菌液。

具体检测结果请见图9，经改造的工程菌在金离子浓度为0.01μm时就有很好的检测效果，且在金离子浓度为10μm时检测效果最好。对菌体进行荧光检测的结果显示在金离子浓度为0.1μmol时，荧光强度依次增加，在10h时达到最大值16000左右。在金离子浓度为1μmol时，荧光强度呈现峰形分布，在5h时达到最大值45000左右。在金离子浓度为5μmol时，荧光强度呈现峰形分布，在5h时达到最大值65000左右。

如此可知：此系统可等效为一个浓度依赖性的化学反应与一个分解反应的偶联，满足动力学方程的浓度作用规律，即起始浓度越高，反应达到平衡所需的时间就越短，而由于分解反应的存在，绿色荧光蛋白最终会降解，因此荧光强度相对时间的函数会呈现峰型分布。

3.混合金属溶液中金离子选择性检测

1)将用于检测金离子的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb液体培养基中于37℃中培养过夜；将过夜培养菌液1:100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)lb液体培养基中于37℃中培养至培养液od600＝0.6，加入金，金、银、铜、镉、镍、锌和银、铜、镉、镍、锌，培养液在37℃中继续培养过夜；

2)培养10h的细菌培养液通过离心(8000转/分钟，2min)收集后，用去离子水清洗1次；

3)清洗后的菌体使用1×pbs缓冲液重悬；

4)使用酶标仪检测重悬后的菌液。

5)具体检测结果请见图7(b)，对菌体进行荧光检测的结果显示混合金属对金离子的荧光检测有微弱影响，金的选择性依然很高。

实施例6金离子检测及吸附系统对金离子选择性能力的检测

1.将用于检测金离子的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb液体培养基中于37℃中培养过夜；将过夜培养菌液1:100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)lb液体培养基中于37℃中培养至培养液od600＝0.6，向培养液中分别加入终浓度为10μm的银、镍、锌、铜、镉、铬、汞、铅离子，培养液在37℃中继续培养10h；

2.培养10h的细菌培养液通过离心(8000转/分钟，2min)收集后，用去离子水清洗1次；

3.清洗后的菌体使用1×pbs缓冲液重悬；

4.使用酶标仪检测重悬后的菌液。

具体检测结果请见图7(a)，经改造的工程菌对金离子有较好的选择性。

实施例7表达lpp-ompa、lpp-ompa-golb融合蛋白的质粒转入宿主菌及宿主菌的培养

1.表达lpp-ompa融合蛋白的质粒转入宿主菌

1)将用于表达lpp-ompa融合蛋白的质粒通过化学转化方法导入大肠杆菌细胞dh5α中，通过在含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb固体培养基上于37℃中培养16小时，从中筛选出阳性克隆并加以保存。

感受态细胞的热激转化和稀释涂布步骤如下：将连接反应的产物于感受态细胞(dh5α)中，手指轻弹混匀；冰浴30分钟后42℃热激95秒，快速转移至冰上；冰浴2分钟后每管加入事先37℃预热好的lb培养基900μl，37℃，200rpm培养1小时使其复苏；3000rpm离心30秒，移去0.9ml上清后，取下层0.1ml涂布相应的抗性平板，37℃培养10小时。

2)重组菌的筛选和鉴定

采用常规菌落pcr法和抽提阳性克隆的质粒后酶切鉴定法，具体可参见《takara限制性内切酶采购目录和技术指南》。测序由上海生物工程技术服务公司完成。lpp-ompa融合蛋白表达质粒测序图谱请见图2。

2.表达lpp-ompa-golb融合蛋白的质粒转入宿主菌

1)将用于表达lpp-ompa-golb融合蛋白的质粒通过化学转化方法导入大肠杆菌细胞dh5α中，通过在含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb固体培养基上于37℃中培养16小时，从中筛选出阳性克隆并加以保存。

感受态细胞的热激转化和稀释涂布步骤如下：将连接反应的产物于感受态细胞(dh5α)中，手指轻弹混匀；冰浴30分钟后42℃热激95秒，快速转移至冰上；冰浴2分钟后每管加入事先37℃预热好的lb培养基900μl，37℃，200rpm培养1小时使其复苏；3000rpm离心30秒，移去0.9ml上清后，取下层0.1ml涂布相应的抗性平板，37℃培养10小时。

2)重组菌的筛选和鉴定

采用常规菌落pcr法和抽提阳性克隆的质粒后酶切鉴定法，具体可参见《takara限制性内切酶采购目录和技术指南》。测序由上海生物工程技术服务公司完成。

3.诱导培养

将用于表达lpp-ompa、lpp-ompa-golb融合蛋白的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)的lb液体培养基中于37℃中培养过夜；将过夜培养菌液1:100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μgml^-1)lb液体培养基中于37℃中培养至培养液od600＝0.6，向培养液中加入终浓度分别为1μm；5μm；20μm进行诱导，培养液在37℃中继续培养过夜。

4.蛋白表达验证

离心收集37℃中培养过夜的细菌(5000rpm，5min)，弃上清液。沉淀使用1mlpbs(含10ul100mm的pmsf)重悬。使用超声波破碎仪破碎收集下来的细菌(10min，超声5s，间歇5s)，后于4℃、12000rpm离心10min，沉淀使用tdsetbuffer(1％tritonx-100，0.2％sodiumdeoxycholate，0.1％sds，10mmtetrasodiumedta，10mmtris/hcl)处理两次。12000rpm离心10min，弃去上清，沉淀使用500μlpbs重悬。

1)sds-page验证

①配制12％sds-page胶，具体配方见下表1。

表1

②取20μl破碎上清液及沉淀重悬液，加入5μl5×样品缓冲液，95℃恒温处理10min。后12000rpm离心10min。

③在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上样，先75v恒压运行30min，后160v恒压50min。

④完成后加入考马斯亮蓝染色液染色20min。

⑤考马斯亮蓝脱色液脱色2次，每次20min。

⑥使用凝胶成像仪在白光下成像、拍照。

2)westernblot验证

①12％sds-page分离蛋白。

②剪下与胶大小相近的pvdf膜，在甲醇中浸泡20s，再用水浸泡2min。

③在电泳槽中加入1l电转液，采用湿式转膜法法转膜，胶与膜的放置顺序为：海绵/滤纸/胶/膜/滤纸/海绵，低温下250ma恒流电转2h。

④转膜完成后，取出膜，在一定方向剪角以区分正反面。使用tbst清洗膜3次，每次5min。

⑤清洗完成后，加入50ml5％脱脂奶粉封闭2h。

⑥封闭完成后，使用tbst清洗膜4次，每次5min。以1：1000稀释的抗flag标签抗体作一抗，4℃孵育过夜。

⑦tbst清洗膜4次，每次5min。使用1：1000稀释的山羊抗小鼠igg-hrp抗体作二抗，常温孵育2h，

⑧tbst清洗膜4次，每次5min。在膜上加400μlcecl低背景化学发光检测剂，使用凝胶成像仪成像、拍照。

结果如图8所示，从左至右分别为：

1:单纯金离子环境下，golb蛋白被大量诱导，由于golb蛋白末端带有之前所述的flag标签，因此可以被荧光抗体识别，最终在胶片上显影产生条带。

2:金离子与其他金属离子混合存在的前提下，gols蛋白仍然能被金离子特异性诱导而失去阻遏能力，导致golb的表达。

3:仅存在其他金属离子时，gols蛋白仍然结合在dna上起到阻遏作用，因此golb蛋白不表达。

实施例8lpp-ompa、lpp-ompa-golb金离子吸附能力的检测

两种工程菌lpp-ompa、lpp-ompa-golb进行吸附实验。实验前两种菌均划线培养于lb固体培养基中(氨苄青霉素抗性)。

金离子浓度对吸附能力的影响

①从两个个培养皿中分别挑取单菌落接种于5mllb(含5ul氨苄青霉素)培养基中，37℃、220rpm培养过夜。

②将细菌培养液以1：100重新接种于100mllb(含100ul氨苄青霉素)培养基中，37℃、220rpm培养至od600＝0.6，加入au³⁺至终浓度分别为1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm继续培养10h。每个实验组设置3个重复。

③收集细菌，弃上清液。ddh2o清洗3次。-80℃冻存6h后用冻干机冻干细菌沉淀。

④称重后用1ml浓硝酸消解至完全，用双蒸水定容至10ml，最后使用电感耦合等离子发射光谱(icp-aes)检测。

具体检测结果请见图10。图中结果显示，lpp-ompa-golb工程菌表现出对金离子强有力的吸附能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>深圳劲宇生物科技有限公司

<120>金离子检测及吸附系统及其宿主菌、金离子回收方法

<160>22

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>45

<212>dna

<213>扩增编码大肠杆菌外膜蛋白ompa的基因的引物

<400>1

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<210>2

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<213>扩增编码大肠杆菌外膜蛋白ompa的基因的引物

<400>2

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<210>3

<211>477

<212>dna

<213>大肠杆菌外膜蛋白ompa的dna序列

<400>3

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<213>扩增编码金离子结合蛋白golb的基因的引物

<400>4

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<210>5

<211>63

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<213>扩增编码金离子结合蛋白golb的基因的引物

<400>5

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<210>6

<211>228

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<213>金离子结合蛋白golb的dna序列

<400>6

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<213>ompa-golb融合蛋白的dna序列

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<213>扩增启动子pgols-gols-pgolb的引物

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<210>9

<211>43

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<213>扩增启动子pgols-gols-pgolb的引物

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<210>10

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<213>启动子pgols-gols-pgolb的序列

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<211>50

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<213>扩增编码红色荧光蛋白rfp的基因的引物

<400>11

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<210>12

<211>41

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<213>扩增编码红色荧光蛋白rfp的基因的引物

<400>12

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<210>13

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<213>红色荧光蛋白rfp的dna序列

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<213>扩增终止子序列terminator的引物

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<213>扩增终止子terminator的引物

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<213>终止子terminator的序列

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<213>扩增启动子pgolb的引物

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<213>扩增启动子pgolb的引物

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<213>启动子pgolb的序列

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<213>扩增编码脂蛋白lpp的基因的引物

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<211>25

<212>dna

<213>扩增编码脂蛋白lpp的基因的引物

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<213>脂蛋白lpp的dna序列

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