一种大型真菌发酵法生产富含岩藻糖的真菌多糖产品的方法与流程

本发明属于食品、保健品领域，具体涉及一种利用大型真菌发酵法生产富含岩藻糖的真菌多糖的方法。

背景技术：

真菌多糖是大型食用和药用真菌类中最有效的成分之一，其药理作用特别受到科技工作者的重视，有关的实验证据也最多。如动物实验证实，灵芝多糖能显著调节机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤、抗辐射、降血糖、保护肝脏等作用。

chunxiao等(2012)研究了大型真菌中灵芝多糖对2型糖尿病模型小鼠血糖的影响，发现灵芝多糖能剂量依赖性地降低实验鼠空腹血糖，其机制是降低了实验小鼠肝脏糖质新生和肝糖降解的关键酶：肝糖磷酸化酶(gp)、葡萄糖-1,6-二磷酸酶(fbpase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepck)、葡萄糖-6-磷酸酶(g6pase)的mrna水平。

chi-hueywong等(2009)试验证实灵芝多糖与乙酸配合使用，可以增加模式生物秀丽隐杆线虫寿命相关转录因子daf-16的表达，蛋白组学对照分析，实验组中15种增寿蛋白有差异性表达。

目前，大型真菌中的灵芝多糖、鲜菇多糖、灰树花多糖等的抗肿瘤和免疫调节活性研究较多。最著名的是chi-hueywong等2013年发表在美国科学院院报的一篇关于灵芝多糖的研究报告，研究发现：试验小鼠通过腹腔注射灵芝多糖可以有效抑制肉瘤s-180和lewis肺癌增殖，证明灵芝多糖具有抗肿瘤活性。进一步系统研究了灵芝多糖的抗肿瘤免疫机制，结果发现：通过对灵芝多糖免疫的小鼠的脾淋巴细胞的免疫活性物质表达谱分析，证实灵芝多糖免疫可以增加小鼠脾淋巴细胞的il-1,il-6,il-12,ifn-c,tnf-a,gm-csf,g-csf和m-csf表达。作用机制是灵芝多糖首先与巨噬细胞的tlr4受体结合，tlr4-灵芝多糖复合物进一步激活胞外信号调节激酶(erk)、c-junn-末端激酶(jnk)和p38，诱导il-1的表达。灵芝多糖还可以强烈引起腹腔b1b细胞增殖，这暗示抗血清中抗糖抗体igm的增加。聚糖微阵列分析显示，灵芝多糖免疫产生的igm可特异性识别肿瘤相关糖抗原的非还原端所含有的fucα1-2gal,fucα1-3/4man,fucα1-4xyl和fucα1-2fuc等特殊结构，这些结构典型存在于肿瘤相关抗原globoh中。推断灵芝多糖抗肿瘤的分子基础在于其特殊的糖组成及其形成的特殊的糖苷键，其中重要的单糖是岩藻糖，岩藻糖苷酶酶解后的灵芝多糖重复上述的抗肿瘤和免疫调节实验，证实灵芝多糖中岩藻糖的重要性。

技术实现要素：

本发明公开了一种大型真菌发酵法生产富含岩藻糖的真菌多糖的方法：是经过菌种选择，利用液体发酵，在基本培养基中添加岩藻多糖，经大型真菌代谢后，产生富含岩藻糖的真菌多糖产品。

与对照相比，本发明的优点和积极效果是：本发明通过在大型真菌发酵培养基中添加来自于褐藻和棘皮动物的岩藻多糖，能极大地提高了大型真菌发酵产物中真菌多糖(有多种单糖通过糖苷键链接而成)中岩藻糖的含量，有研究显示真菌多糖中重要的单糖-岩藻糖对与真菌多糖的抗肿瘤活性和免疫调节活性十分重要。因此本发明生产的富含岩藻糖的真菌多糖制品将为肿瘤治疗提供有益的辅助，提高人体的免疫能力，为人类健康提供有益的帮助，具有重大的市场应用价值。

附图说明

图1液体发酵灵芝多糖中的单糖组成离子色谱分析；

图中包括标准单糖，fucose(岩藻糖)，arabinose(阿拉伯糖)，galactose(半乳糖)，glucose(葡萄糖)，xylose(木糖)，mannose(甘露糖)的离子色谱分析；该标准单糖离子色谱图：1.岩藻糖，2.阿拉伯糖，3.半乳糖，4.葡萄糖，5.木糖和甘露糖。

图2液体发酵灵芝多糖中的单糖组成离子色谱分析；

图中曲线1为发酵基本培养基中添加5g/l甘露糖，曲线2为发酵基本培养基；

图3液体发酵灵芝多糖中的单糖组成离子色谱分析；

图中曲线1为发酵基本培养基，曲线2为发酵基本培养基中添加5g/l岩藻糖；

图4液体发酵灵芝多糖中的单糖组成离子色谱分析；

图中曲线1为发酵基本培养基，曲线2-6为发酵基本培养基中添加岩藻多糖分别为0.5g/l，1.0g/l，1.5g/l，3.0g/l，4.0g/l。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明的一种大型真菌发酵法生产富含岩藻糖的真菌多糖的方法，步骤是：

1)选择大型真菌中的一种(如灵芝，虫草，香菇，或灰树花等)灵芝作为发酵用菌种；

2)采用液体发酵，基本培养基中添加岩藻多糖，在一定的发酵条件下发酵一定时间；

所述基本培养基为pda改良培养基(基本配方为土豆泥30.0-40.0g/l，麸皮汁30.0-40.0g/l，葡萄糖5.0-15.0g/l，磷酸二氢钾1-2g/l，mgso4·7h2o0.5-1g/l，ph自然)。本发明对pda培养基进行了改良，可以降低成本，节约资源。

所述岩藻多糖优选为来自于褐藻的岩藻多糖，添加浓度为岩藻多糖干粉0.5–4.0g/l(岩藻多糖干粉中岩藻多糖含量≥60％)。

实施例1

添加褐藻提取的岩藻多糖干粉，利用泰山赤灵芝发酵，生产富含岩藻糖的灵芝多糖方法：

1)用pda斜面保存泰山赤灵芝菌种，培养基为pda培养基，加1.5％的琼脂粉，121℃灭菌30分钟，制成试管斜面，接种泰山赤灵芝，30℃培养4-5天制成斜面种子；

2)制备液体摇瓶泰山赤灵芝种子液：培养基为pda培养基，121℃灭菌30分钟；冷却后，用上述培养好的试管斜面种子接种；30℃，摇床180rpm，培养4天，得到培养好的泰山赤灵芝摇瓶种子；

3)一级发酵罐发酵：将制备好的摇瓶泰山赤灵芝液体种子按10％(v/v)的量接种到经过121℃灭菌30分钟，然后冷却至30℃的一级发酵罐中，进行通气搅拌发酵，定时取样分析，确定终点，作为种子待转到二级发酵罐。

上述一级发酵罐培养基配方是改良的pda培养基(单位g/l)：土豆泥40，40g麸皮煮沸30分钟过滤取汁，葡萄糖10.0，kh2po41.5，mgso4·7h2o0.75。

4)二级发酵罐发酵：将一级发酵好的菌种按10％(v/v)的量转到经过121℃灭菌30分钟，然后冷却至30℃的二级发酵罐中，通气搅拌发酵，定时取样分析，确定发酵终点作为种子待转到三级发酵罐。

上述二级发酵罐培养基配方是改良的pda培养基(同上)。

5)三级发酵罐发酵：将二级发酵好的菌种按10％(v/v)的量转到经过121℃灭菌30分钟，然后冷却至30℃的三级发酵罐中，通气搅拌发酵，定时取样分析，发酵终点。

上述三级发酵罐培养基配方是改良的pda培养基(同上)，添加岩藻多糖0.5g/l。

实施例2

制备方法如实施例1，区别在于所述三级发酵罐培养基中添加1.0g/l岩藻多糖。

实施例3

制备方法如实施例1，区别在于所述三级发酵罐培养基中添加1.5g/l岩藻多糖。

实施例4

制备方法如实施例1，区别在于所述三级发酵罐培养基中添加3.0g/l岩藻多糖。

实施例5

制备方法如实施例1，区别在于所述三级发酵罐培养基中添加4.0g/l岩藻多糖。

对比例1

制备方法如实施例1，区别在于所述三级发酵罐培养基中添加5g/l甘露糖。

对比例2

制备方法如实施例1，区别在于所述三级发酵罐培养基中添加5g/l岩藻糖。

将上述实施例与对比例中，分离纯化的灵芝多糖的单糖组成进行离子色谱分析。如表1和图1-4所示的，表中的数值为峰面积。

表1基本培养基中不同底物添加发酵灵芝中灵芝多糖的岩藻糖、葡萄糖及其比值的变化

上述实施例中涉及的分析方法汇总如下：

1.菌丝形态和菌丝球密度用镜检分析，染色用革兰氏染色法，用常规光学显微镜油镜观察，最大倍数1500倍。

2.ph用ph计测定。

3.多糖分析实验采用两次dns法，第一次dns法分析发酵液中残留还原糖，然后发酵液用3n盐酸，100℃水解30分钟，中和后，第二次dns法分析水解后的发酵液中还原糖，两次分析差值为灵芝多糖含量。

本发明中涉及的菌种购自天津生物芯片技术有限责任公司。

根据岩藻糖的体内合成途径：分为补救途径和从头合成途径，本发明在灵芝多糖的液体发酵培养过程中，在培养基中添加不同浓度的岩藻糖单糖，甘露糖单糖以及来自于海洋褐藻的富含岩藻糖的多糖(即岩藻多糖)，来研究能否增加灵芝多糖中的岩藻糖含量，寻找能使灵芝多糖中岩藻糖含量达到最高的最佳添加物及浓度，以获得富含岩藻糖的灵芝多糖。结果显示(图1-4和表1)：在基本培养液中添加来自于褐藻的岩藻多糖，添加浓度为岩藻多糖干粉0.5-4.0g/l，当添加岩藻多糖干粉小于等于3.0g/l时，可以逐步地提高灵芝多糖单糖组成中的岩藻糖含量，当基本培养基中添加3.0g/l岩藻多糖干粉，岩藻糖与葡萄糖比值最高达到0.594；而当添加4.0g/l岩藻多糖干粉时，灵芝生长量减少，岩藻糖与葡萄糖比值也减少，具体原因需继续分析。

以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。