一株副干酪乳杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株副干酪乳杆菌及其应用，属于食品防腐领域。

背景技术：

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)归类于乳酸菌科。特征是革兰氏染色阳性，无芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，耐酸的球菌或杆菌。并能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌。乳酸菌广泛存在于人和动物肠道、许多食品中。乳酸菌不但可以提升食品的营养价值，改善食品风味，并帮助改善食品的保藏性。还可以调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，对人和动物健康都有益。乳酸菌通过发酵碳水化合物，可以分泌大量有机酸，乳酸菌素，过氧化氢等抑菌物质来抑制腐败菌的生长来改善食品的风味和品质。

粉条，是以红薯，马铃薯等为原料，经过磨浆沉淀等加工后制成的丝条状干燥的特色传统食品。一般鲜粉条的保质期在10天左右，尤其在夏季，保质期更短往往在4，5天就已经开始腐败了。而通过添加食品添加剂，防腐剂来延长保鲜时间，对产品风味会有影响，对人体也不好。乳酸菌产生的有机酸，乳酸菌素等能抑制大量腐败菌的生长。但是产酸能力过强的乳酸菌也会导致粉条的口感、质感下降，风味不佳等问题。

菊粉是植物中储备性多糖，可以稳定血糖，防止并发症，降低血脂防止心血管疾病等功效。它作为膳食纤维，促进矿物元素尤其是钙元素吸收。另外，菊粉是一种益生素，能够使乳酸菌增殖，从而促进肠道有益菌繁殖，对人体健康大有益处。而乳酸菌通过发酵菊粉可以使其转化为一些果糖，低聚糖使人体易于吸收，而发酵产生的有机酸也能促进人体肠道消化。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明筛选得到一株产酸能力适中，并且高效利用菊粉的副干酪乳杆菌。

本发明的第一个目的是提供一株副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)dy2，所述副干酪乳杆菌dy2已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为副干酪乳杆菌dy2lactobacillusparacaseidy2，保藏编号为cctccno:m2017303，保藏地址为中国武汉武汉大学。

在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌dy2是一种兼性细菌，在好氧或厌氧条件下均能生存和生长，在厌氧条件下生长迅速。

在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌dy2经革兰氏染色确定为革兰氏阳性菌，平板培养基菌落中等大小，凸起，白色湿润。

在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌dy2能够利用半乳糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖或木糖产酸。

本发明的第二个目的是提供所述副干酪乳杆菌dy2在食品防腐中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用副干酪乳杆菌dy2抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌在食品中繁殖。

本发明的第三个目的是提供所述副干酪乳杆菌dy2在粉条保鲜中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将副干酪乳杆菌dy2以1-4％的接种量加入粉条中。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将副干酪乳杆菌dy2以2％的接种量加入粉条中。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是在温度为35-38℃条件下进行粉条保鲜。

本发明的第四个目的是提供所述副干酪乳杆菌dy2在发酵消化益生元菊粉中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种包含所述副干酪乳杆菌dy2的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。

本发明有益效果

本发明的副干酪乳杆菌可以有效的延长鲜粉条的保藏时间，防止粉条的快速腐败，比未加副干酪乳杆菌的粉条保藏时间提高了6天。同时，本发明的副干酪乳杆菌产酸能力适中，不会导致粉条酸化，并能保持住粉条的风味。此外，本发明的副干酪乳杆菌能高效利用益生元菊粉，利于肠道消化，有助于人体肠道健康。

生物材料保藏

本发明的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)dy2，已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为副干酪乳杆菌dy2lactobacillusparacaseidy2，保藏编号为cctccno:m2017303，保藏地址为中国武汉武汉大学。

附图说明

图1是副干酪乳杆菌在平板培养基形态；

图2是副干酪乳杆菌在mrs培养基生长曲线；

图3是副干酪乳杆菌生长过程中ph变化曲线；

图4是副干酪乳杆菌在菊粉发酵培养基生长曲线。

具体实施方式

实施例1：菌株的筛选

本发明菌株采用平板稀释分离法从酸菜样品中分离筛选出抑菌效果好的菌株。

分离筛选方法如下所述：

1、混合菌种的稀释：从购买的酸菜样品，将1g酸菜放入mrs培养基37℃培养24小时，并进行菌种的梯度稀释。

2、mrs培养基：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温801ml，蒸馏水1l，115℃灭菌20分钟。

3、菌株的初筛：取梯度稀释后的菌液100微升涂于初筛添加有溴甲酚紫的mrs固体培养基平板，37℃培养24小时。选择生长快、菌落大、黄色菌圈大的菌株，经过多次初筛，得到3株乳酸菌种，将其编号为dy1-dy3。

4、菌种的复筛：将初筛出来的3株菌接入到复筛液体培养基(蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温801ml，蒸馏水1l，ph6.5)，37℃200rpm培养24h，按照实施例3的方法测定其抑菌效果。

5、最优菌种的筛选：dy2相对于dy1，dy3抑菌效果最佳。最终筛选出编号dy2的菌种作为保鲜菌株。

6、菌种的鉴定：将筛选出来的菌种dy1-dy3涂布于mrs固体培养基，挑取单菌落利用通用引物1492r和27f进行扩增，将扩增产物交由生工生物工程(上海)有限公司进行16srrna测序，序列所得结果通过ncbi的nucleotideblast与genbank中的模式菌株进行同源性比对。比对结果显示与genbank中相关模式菌株的16srna有99％的相似性，确定该菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)。

图1是本发明的副干酪乳杆菌dy2在平板培养基上的形态图片。副干酪乳杆菌dy2的16srrna序列如seqidno:1所示。

所述副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)dy2，已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017303。

实施例2：副干酪乳杆菌dy2生理生化特征的鉴定

生理生化特征：

(1)石蕊牛奶实验：牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在其中加入石蕊作指示剂和氧化还原指示剂，石蕊在中性时呈淡紫色酸性时呈粉红色碱性时呈蓝色还原时，则自上而下使牛奶褪色还原为白色。乳酸细菌发酵乳糖产酸，石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。观察接种和培养后的石蕊牛奶实验结果，37℃培养一天即可观测石蕊牛奶产酸和凝固反应。

(2)过氧化氢酶测定：将实验菌接种于pyg培养基斜面上，37℃培养24h，取培养物，涂在干净的载玻片上，然后在其上滴加5％的过氧化氢，有气泡的则为阳性反应，无气泡为阴性反应。

(3)淀粉水解实验：将菌种接种于含有可溶性淀粉的基础培养基中，37℃培养24h，取少许培养液于比色盘内，同时取未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液。不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。

(4)明胶液化实验：将实验菌株接种于含有明胶的基础培养基中，置37℃培养24h，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于4℃冰箱中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。

(5)v-p实验：将实验菌接种于pyg培养基中，37℃培养24h，取培养液在其中加入茶酚和氢氧化钾，置于不加盖的试管中混合，并陆续振荡30分钟，显示红色为阳性反应。

(6)葡聚糖实验：将新鲜的培养物接种于含有蔗糖的培养基斜面上，37℃培养24h。斜面上培养物形成粘稠的菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。

(7)硫化氢实验：将新鲜的培养物接种于含有半胱氨酸或胱氨酸的培养基中，用无菌的镊子夹取一乙酸铅滤纸条悬挂于接种试管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，实验中设空白对照，在没接种的试管培养基上悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养24h，进行观察比较，纸条变黑色为阳性反应。

(8)葡萄糖产气：在1升py基础培养基内加入20g葡萄糖和0.5％的吐温80，再添加6g琼脂和的澳甲酚紫作指示剂，分装试管。把菌液滴加入上述融化的培养基中，充分混匀，再在上面加一层7mm厚的的琼脂，置37℃培养24h。软琼脂柱内有气泡或出现将的琼脂层向上顶的现象，表示产气。

(9)精氨酸产氨：接种新鲜的实验菌种于含精氨酸的培养基中，并同时接种不含精氨酸的培养基作对照，置37℃培养一天，取少许培养液于比色盘中，加奈氏试剂数滴，当产氨时会出现橙黄或黄褐的沉淀。含精氨酸培养液与试剂的反应强于对照液才能是阳性反应。

糖发酵实验：将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入基础培养基中，分别分装到5ml试管。37℃，振荡培养24h。检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的培养液作为对照，滴加btb-mr试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。

dy2菌株的生理生化特性见表1，表2，为石蕊牛奶，v-p实验阳性，淀粉水解、过氧化氢酶、硫化氢实验、葡聚糖、葡萄糖产气、精氨酸产氨、明胶液化呈阴性。能发酵利用麦芽糖，鼠李糖，d-半乳糖，甘露糖，阿拉伯糖产酸，产气。

表1dy2菌的生理特性

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性

表2dy2菌糖发酵结果

注：“+”表示强发酵，“d”表示略微发酵

实施例3：副干酪乳杆菌抑菌性研究

指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌三种指示菌接种于lb液体培养基，37℃培养24h。

采用牛津杯法：取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基18-20ml，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼脂培养基(琼脂含量为1％)适量加热融化后，放冷至48-50℃，没50-100ml培养基加入指示菌菌悬液0.1-0.2ml，在每1个平板中分别加入5ml，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。在每1平板中以等距离均匀安置牛津杯4个备用，每个双层平板中的牛津杯中分别滴装200μl乳酸菌上清液，37℃培养18h后，测量各抑菌圈直径以作出评价。

结果表明：副干酪乳杆菌dy2对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用且效果优秀，抑制效果略低于购买的副干酪乳杆菌cicc22709。

表3副干酪乳杆菌抑菌效果

实施例4：副干酪乳杆菌发酵菊粉实验

活化培养基：蛋白陈10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1000ml。乳酸发酵培养基：蛋白陈10.0g，酵母粉10g，菊粉10.0g，葡萄糖10.0g，无水氯化钙0.01g，氯化钠0.08g，七水硫酸镁0.8g，磷酸氢二钾0.04g，磷酸二氢钾0.04g，碳酸氢钠0.4g，去离子水1000ml，ph调至6.5，115℃高压灭菌20min-30min。从斜面上挑取乳酸菌接种于上述活化培养基，37℃，200rpm振荡培养12h，再以2％的接种量转接到乳酸发酵培养基。37℃培养24h测定生长状况。

菊粉的含量测定通过苯酚硫酸法进行测定，菊粉含量等于总糖含量减去还原糖的量，总糖的含量通过苯酚硫酸法测定，还原糖的含量通过dns法测定。

结果表明：副干酪乳杆菌dy2相对于dy1，dy3以及购买的副干酪乳杆菌cicc22709对菊粉有更好的利用率，另外相对于植物乳杆菌，鼠李糖乳杆菌有特别明显的优势。另外关于副干酪乳杆菌利用菊粉的研究还比较少，但表现出优于其他菌株的优先效果。

表4乳酸菌发酵消化菊粉情况

实施例5：副干酪乳杆菌粉条保鲜实验

(1)乳酸菌菌液制备：将保存管中的副干酪乳杆菌按2％的接种量接种于mrs液体培养基中进行活化，37℃下活化24h，再以1％的接种量转接于mrs液体培养基中，37℃培养24h，获得菌液。

(2)粉条的制备：选用马铃薯淀粉，用淀粉量50％的热水将淀粉调成稀糊状，然后再用沸水向调好的淀粉稀糊中猛冲，迅速搅拌，加入0.5％的明矾，通过压粉机将粉压入沸水，反应40秒，迅速用冷水冷却，将水沥干，称重保持每袋粉条重量约250g。

(3)乳酸菌的添加：取10袋粉条为一组，以2％的乳酸菌添加量分别加入副干酪乳杆菌dy1、dy2、dy3和cicc22709。

(4)菊粉的添加：另外在每袋250g的粉条加入10g的菊粉，进行混合均匀。

在第10天进行感官评价，结果如表6所示，结果表明副干酪乳杆菌dy2的保藏时间最长，且粉条风味保持较好，而购买的副干酪乳杆菌cicc22709，由于产酸能力强，导致最终粉条酸味过重，弹性下降。

表5副干酪乳杆菌粉条保藏效果

实施例5：副干酪乳杆菌dy2菌添加量对粉条保藏效果

(1)乳酸菌菌液制备：将保存管中的副干酪乳杆菌按2％的接种量接种于mrs液体培养基中进行活化，37℃下活化24h，再以1％的接种量转接于mrs液体培养基中，37℃培养24h，获得菌液。

(2)粉条的制备：选用马铃薯淀粉，用淀粉量50％的热水将淀粉调成稀糊状，然后再用沸水向调好的淀粉稀糊中猛冲，迅速搅拌，加入0.5％的明矾，通过压粉机将粉压入沸水，反应40秒，迅速用冷水冷却，将水沥干，称重保持每袋粉条重量约250g。

(3)乳酸菌的添加：取10袋粉条为一组，第一组作为对照不添加乳酸菌，第二组以0.5％的乳酸菌添加量加入粉条，第三组以1％的乳酸菌添加量加入，第四组以1.5％的乳酸菌添加量加入，第五组以2％的乳酸菌添加量加入，第六组以3％的乳酸菌添加量加入，第七组以4％的乳酸菌添加量加入。

(4)菊粉的添加：另外在每袋250g的粉条加入10g的菊粉，进行混合均匀。

表6副干酪乳杆菌添加量对粉条保藏效果

结果表明，添加副干酪乳杆菌有助于提高粉条的保藏期限，不添加的保藏期限效果明显很差，在自然状态下，副干酪乳杆菌的添加量与保藏期限密切相关，接种量为2％时，保藏效果最佳达到了14天，比未添加的整整提高了6天。说明副干酪的乳杆菌的添加可以有效的提高鲜粉条的保藏期限。可以很好应用于食品保藏。另外添加菊粉在食用后可以很好的刺激肠道乳酸菌增值，进一步延长其保藏时间，而菊粉作为益生元也有益于健康。

实施例6：副干酪乳杆菌dy2对粉条风味物质的影响

根据形态，色泽，气味与滋味，杂质情况对粉条进行感官评价。

表7粉条的感官指标

评分标准：5分最好；4分好；3分一般；2分不合格；1分太差

表8不同接种量感官评分

结果表明：2％的接种量对粉条感官影响最好，过低的接种量并不能对粉条进行有效的保藏，而过高的接种量虽然可以有效的提高保藏时间，但过高的接种量会导致感官受影响，导致粉条过酸，影响口感。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一株副干酪乳杆菌及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>968

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

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