一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的制作方法

本发明公开一种生物技术领域，涉及一种核酸恒温扩增技术，特别涉及一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒。

背景技术：

狂犬病是一种人兽共患病，多见于犬、猫等肉食动物，人多因被病兽咬伤而感染。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，单股rna病毒，动物通过互相间的撕咬而传播病毒。狂犬病主要包括7种基因型，分别为：基因1型经典狂犬病病毒rabiesvirus（rabv）；基因2型的lagosbatvirus（lbv）；基因3型的mokolavirus（mokv）；基因4型的duvenhagevirus（duvv）；基因5型的europeanbatlyssavirus1（eblv-1）；基因6型的europeanbatlyssavirus2（eblv-2）；基因7型的australianbatlyssavirus（ablv）。

狂犬病具有一定的潜伏期，潜伏期长短也会因为每个人的体质而不同，多数在3个月以内，潜伏期的长短与年龄（儿童较短）、伤口部位（头面部咬伤的发病较早）、伤口深浅（伤口深者潜伏期短）、入侵病毒的数量及毒力等因素有关。如何快速有效地检测狂犬病，是目前仍需要解决的一个问题。

目前，国内对狂犬病病毒的检测方法主要有：荧光抗体试(fluorescentantibodytest,fat)、快速狂犬病酶免疫诊断法(rapidrabiesenzymeimmunodetection,rreid)、基因芯片检测等。其中，fat需要荧光显微镜，且荧光阳性和阴性不易辨认。rreid和胶体金免疫层析法简单、快速，但灵敏度不够。基因芯片法，判断准确但是需要特定仪器，耗时较长。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，能够解决现有技术检测耗时、检测结果不易辨认等问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，包括rna提取试剂、pcr反应液、酶系、特异性引物、探针、阳性对照品、阴性对照品，所述检测1型狂犬病病毒的上游引物序列为seqidno：1，所述检测1型狂犬病病毒的下游引物序列为seqidno：2；所述检测2-7型狂犬病病毒的上游引物序列为seqidno：9，所述检测2-7型狂犬病病毒的下游引物序列为seqidno：10；所述检测1-7型狂犬病病毒的内标上游引物序列为seqidno：17，所述检测1-7型狂犬病病毒的内标下游引物序列为seqidno：18；所述检测1型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：19，所述检测2型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：20，所述检测3型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：21，所述检测4型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：22，所述检测5型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：23，所述检测6型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：24，所述检测7型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：25，所述检测1-7型狂犬病病毒的内标荧光探针序列为seqidno：26。

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其rna提取试剂的组分包括：

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其pcr反应液的组分包括：

优选的，所述tris-缓冲液可选自tris-h2so4、tris-乙酸、tris-hcl中的任意一种或多种，tris-缓冲液的ph为6.0～9.0。

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其酶系的组分包括：

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其1-7型狂犬病病毒探针连接的荧光基团及内标探针连接的荧光基团均可选自fam、hex、tex、vic、cy5中的任一基团，其1-7型狂犬病病毒探针连接的荧光基团不同于内标探针连接的荧光基团。

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其恒温扩增的温度为40～45℃。

优选的，一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的rna提取试剂的具体组分如下：

优选的，一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的pcr反应液的具体组分如下：

优选的，一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的酶系的具体组分如下：

优选的，一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其恒温扩增的温度为40℃。

优选的，一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其特异性引物及探针序列如下：

优选的，荧光探针1（seqidno：19）用于检测1型狂犬病并连接fam荧光基团，荧光探针2（seqidno：20）、3（seqidno：21）、4（seqidno：22）分别用于检测2、3、4型狂犬病并连接hex荧光基团，荧光探针5（seqidno：23）、6（seqidno：24）、7（seqidno：25）分别用于检测5、6、7型狂犬病并连接tex荧光基团，荧光探针8（seqidno：26）作为内标参考并连接cy5荧光基团。

优选的，一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，其阳性对照品和阴性对照品的主要成分如下：

本发明的有益效果为：

本发明采用恒温扩增技术，恒温扩增的温度为40～45℃，扩增时间为30min～40min，而且扩增的明敏度和准确性高，结果可靠。

本发明的采用的恒温扩增技术对仪器的要求低，几乎适用于目前市面上95%的荧光pcr扩增仪。

本发明在恒温扩增的技术上以单链rna为模板通过碱基互补配对原则。以大量已知序列的特定rna基因片段作为探针，检测样品中与其互补的核酸序列，然后通过特定的检测系统对荧光信号进行检测，完成对样本的定性与分型。为狂犬病的快速诊断起到不可估量的价值。

附图说明

图1至图3依次分别为实施例1至实施例3的目的基因的荧光结果图，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号；

图4为本发明中实施例4中rva4组检测1型狂犬病病毒引物的荧光结果图；

图5为本发明中实施例4中rvb4组检测2-7型狂犬病病毒的引物的荧光结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒，包括rna提取试剂、pcr反应液、酶系、特异性引物、探针、阳性对照品、阴性对照品，所述检测1型狂犬病病毒的上游引物序列为seqidno：1，所述检测1型狂犬病病毒的下游引物序列为seqidno：2；所述检测2-7型狂犬病病毒的上游引物序列为seqidno：9，所述检测2-7型狂犬病病毒的下游引物序列为seqidno：10；所述检测1-7型狂犬病病毒的内标上游引物序列为seqidno：17，所述检测1-7型狂犬病病毒的内标下游引物序列为seqidno：18；所述检测1型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：19，所述检测2型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：20，所述检测3型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：21，所述检测4型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：22，所述检测5型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：23，所述检测6型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：24，所述检测7型狂犬病病毒的荧光探针序列为seqidno：25，所述检测1-7型狂犬病病毒的内标荧光探针序列为seqidno：26。

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的rna提取试剂的具体组分如下：

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的pcr反应液的具体组分如下：

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的酶系的具体组分如下：

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的特异性引物及探针序列如下：

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒阳性对照品和阴性对照品的主要成分如下：

下面以具体的实验，说明狂犬病恒温检测试剂盒所存在的优势：

实施例1：狂犬病检测（以感染狂犬病患者的组织为样本）

1.样本预处理：组织样本加入1ml0.9%生理盐水研磨成组织悬液，待检；

2.取组织悬液250μl，5000rpm/min离心10min，弃上清，保留沉淀（若无沉淀保留约30ul液体）。

3.加入100μlrna提取试剂，震荡30s，5000rpm/min离心10min，取上清，置于1.5ml的离心管中。

4.取3个200μl反应管，并标记为1号、2号、3号。分别往管内（1号、2号、3号）加入25μl的pcr反应液、5μl的pcr反应酶系；5μl引物混合液（检测1型狂犬病病毒的上游引物、检测1型狂犬病病毒的下游引物、检测2-7型狂犬病病毒的上游引物、检测2-7型狂犬病病毒的下游引物、内标上游引物、内标下游引物浓度均为0.2μmol/l），5μl探针混合液（荧光探针1、荧光探针2、荧光探针3、荧光探针4、荧光探针5、荧光探针6、荧光探针7、荧光探针8探针浓度分别为0.08μmol/l）。在反应管1加入狂犬病组织提取未知浓度的核酸10μl；在反应管2中加入阳性质控品10μl；在反应管3中加入阴性质控品10μl。最后，各管的终体积为50μl。

5pcr扩增反应，反应参数：40℃,40s，45个循环，每个循环都收集荧光。结果如图1。

实施例2：重复性测试

取3个200μl反应管，并标记为1号、2号、3号、4号、5号、6号。分别往管内（1号、2号、3号、4号、5号、6号）加入25μl的pcr反应液、5μl的pcr反应酶系；5μl引物混合液（检测1型狂犬病病毒的上游引物、检测1型狂犬病病毒的下游引物、检测2-7型狂犬病病毒的上游引物、检测2-7型狂犬病病毒的下游引物、内标上游引物、内标下游引物浓度均为0.2μmol/l），5μl探针混合液（荧光探针1、荧光探针2、荧光探针3、荧光探针4、荧光探针5、荧光探针6、荧光探针7、荧光探针8探针浓度分别为0.08μmol/l）。在反应管1号、2号、3号、4号、5号、6号中加入狂犬病组织提取的浓度为1ng/ul的核酸10μl；各管的终体积为50μl。反应参数：40℃,40s，45个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。

实施例3：梯度测试

取6个200μl反应管，并标记为1号、2号、3号、4号。分别往管内（1号、2号、3号、4号）加入25μl的pcr反应液、5μl的pcr反应酶系；5μl引物混合液（检测1型狂犬病病毒的上游引物、检测1型狂犬病病毒的下游引物、检测2-7型狂犬病病毒的上游引物、检测2-7型狂犬病病毒的下游引物、内标上游引物、内标下游引物浓度均为0.2μmol/l），5μl探针混合液（荧光探针1、荧光探针2、荧光探针3、荧光探针4、荧光探针5、荧光探针6、荧光探针7、荧光探针8探针浓度分别为0.08μmol/l）。在反应管1加入狂犬病组织提取的浓度为1000ng/ul的核酸10μl；在反应管2加入狂犬病组织提取的稀释10倍浓度为100ng/ul核酸10μl；在反应管3加入狂犬病组织提取的稀释100倍浓度为10ng/ul核酸10μl；在反应管4加入狂犬病组织提取的稀释1000倍浓度为1ng/ul的核酸10μl；最后，各管的终体积为50μl。反应参数：40℃,40s，45个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。

实施例4：特异性引物的设计与筛选

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的特异性引物及探针序列设计过程：根据genbank数据库中登录的lv各基因型全基因序列和n基因序列，利用生物软件primerpremier6.0和oligo6.0设计好的引针在ncbinucleotide数据库中进行blast评价，剔除与目的基因相似性低于70%且与非目的基因相似性高于40%的引针。针对常见的基因1型狂犬病和不常见的基因2-7型狂犬病，共设计8组上下游引物，其中有检测基因1型狂犬病病毒rva有4组（rva1、rva2、rva3、rva4）和检测基因2-7型狂犬病病毒rvb有4组（rvb1、rvb2、rvb3、rvb4），内参引物为rvc组。

一种狂犬病病毒分型恒温检测试剂盒的特异性引物及探针序列筛选过程：

使用实施例1提取的临床样本，根据ct值最小和荧光信号增幅最大原则进行筛选。筛选结果显示rva1和rvb1这两组的灵敏度较高，而rva2、rva3、rva4和rvb2、rvb3、rvb4的灵敏度比较差，结果如图4和图5。因此选择rva1组作为检测1型狂犬病病毒的上下游引物序列，选择rvb1组作为检测2-7型狂犬病病毒的上下游引物序列。

结果判读：

每次试验应设置阳性对照和阴性对照，阴性对照无ct值或ct值＞40，阳性对照ct值≤40并根据下表对临床样本进行阴性和阳性判断

结论：

1.从图1的结果可以看出，样本扩增结果都有“s”型扩增曲线，说明本发明试剂盒的恒温扩增效果好。

2.从图2的结果可以看出，同样的样本都有“s”型扩增曲线且基本一致，说明本发明试剂盒的重复性好。

3.从图3的结果可以看出，加入梯度稀释的核酸可以扩增出较好的“s”型梯度曲线，说明本发明试剂盒的稳定性高，结果可靠。

4.从图4的结果可以看出，加入同样的样本都有“s”型扩增曲线，但是rva1组引物ct值最小，荧光值最高，说明rva1组引物的检测效果最好。

5.从图5的结果可以看出，加入同样的样本都有“s”型扩增曲线，但是rvb1组引物ct值最小，说明rvb1组引物的检测效果最好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>广州和实生物技术有限公司

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