用于幽门螺杆菌个体化基因检测的ARMS‑qPCR方法和试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr方法和试剂盒。

背景技术：

幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)是一种微需氧的螺杆菌，hp感染与慢性活动性胃炎、消化性溃疡和胃癌等疾病密切相关。据报道，世界范围内有近一半人口被hp感染，中国也属hp高发区，平均感染率高达40％-80％。目前，影响hp感染个体化根除治疗疗效的因素主要包括两方面：宿主和抗生素耐药性。宿主主要包括cyp2c19的基因多态性会明显影响质子泵抑制剂(protonpumpinhibitors，ppi)代谢水平及抑酸效果，对hp根除疗效产生影响；hp抗生素耐药性主要以三联疗法中克拉霉素和左氧氟沙星的耐药为主，其中，与克拉霉素耐药性相关的点突变主要包括23srrna基因的a2142g和a2143g位点；gyra基因的n87k、d91n/g/y两个位点氨基酸置换是导致hp耐左氧氟沙星的主要位点。

扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，arms)是newton等首先建立用来检测已知突变的方法，该方法的设计的突变引物与待检测位点的3′端突变碱基匹配，用于特异性检测突变型。为了提高引物特异性，可在引物的3′端的第2个和第3个碱基引入一个或两个错配碱基以阻止野生型的延伸。

arms-qpcr技术基于real-timepcr平台，结合arms突变富集和taqman特异性荧光检测两种技术。利用arms引物对突变靶序列进行pcr扩增，taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在real-timepcr基础上鉴定特定突变。

因此，需要提供一种有效检测幽门螺杆菌的arms-qpcr方法，实现高特异性、高灵敏性的检测。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr引物组合。

本发明的第二个目的在于提供一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr试剂或试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr引物组合物，所述arms-qpcr引物组合物包括引物组合a、引物组合b、引物组合c、引物组合d、引物组合e和引物组合f，如下述1)、2)、3)、4)、5)和6)所示：

1)引物组合a由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2g引物、cyp2c19*3g引物、cyp2c19*17c引物、taqman探针*2、taqman探针*3、taqman探针*17组成；

2)引物组合b由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2a引物、cyp2c19*3a引物、cyp2c19*17t引物、taqman探针*2、taqman探针*3、taqman探针*17组成；

3)引物组合c由上游引物-1、a2142g突变型引物、a2143g突变型引物、taqman探针-1组成；

4)引物组合d由87k-1引物、87k-2引物、下游引物-1、taqman探针-2组成；

5)引物组合e由91n引物、91g引物、91y引物、下游引物-1、taqman探针-2组成；

6)引物组合f由上游引物-2、下游引物-2和外控探针组成；

其中，

所述上游引物*2的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示；

所述cyp2c19*2g引物的核苷酸序列如序列表seqidno.2所示；

所述cyp2c19*2a引物的核苷酸序列如序列表seqidno.3所示；

所述taqman探针*2的核苷酸序列如序列表seqidno.4所示；

所述上游引物*3的核苷酸序列如序列表seqidno.5所示；

所述cyp2c19*3g引物的核苷酸序列如序列表seqidno.6所示；

所述cyp2c19*3a引物的核苷酸序列如序列表seqidno.7所示；

所述taqman探针*3的核苷酸序列如序列表seqidno.8所示；

所述上游引物*17的核苷酸序列如序列表seqidno.9所示；

所述cyp2c19*17c引物的核苷酸序列如序列表seqidno.10所示；

所述cyp2c19*17t引物的核苷酸序列如序列表seqidno.11所示；

所述taqman探针*17的核苷酸序列如序列表seqidno.12所示；

所述上游引物-1的核苷酸序列如序列表seqidno.13所示；

所述taqman探针-1的核苷酸序列如序列表seqidno.14所示；

所述a2142g突变型引物的核苷酸序列如序列表seqidno.15所示；

所述a2143g突变型引物的核苷酸序列如序列表seqidno.16所示；

所述下游引物-1的核苷酸序列如序列表seqidno.17所示；

所述taqman探针-2的核苷酸序列如序列表seqidno.18所示；

所述87k-1引物的核苷酸序列如序列表seqidno.19所示；

所述87k-2引物的核苷酸序列如序列表seqidno.20所示；

所述91n引物的核苷酸序列如序列表seqidno.21所示；

所述91g引物的核苷酸序列如序列表seqidno.22所示；

所述91y引物的核苷酸序列如序列表seqidno.23所示；

所述上游引物-2的核苷酸序列如序列表seqidno.24所示；

所述下游引物-2的核苷酸序列如序列表seqidno.25所示；

和所述外控探针的核苷酸序列如序列表seqidno.26所示。

优选的，所述引物组合a中上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2g引物、cyp2c19*3g引物、cyp2c19*17c引物、taqman探针*2、taqman探针*3、taqman探针*17的摩尔比为3∶3∶2∶3∶3∶2∶2∶2∶1；

所述引物组合b中上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2a引物、cyp2c19*3a引物、cyp2c19*17t引物、taqman探针*2、taqman探针*3、taqman探针*17的摩尔比为3∶3∶2∶3∶3∶2∶2∶2∶1；

所述引物组合c中上游引物-1、a2142g突变型引物、a2143g突变型引物、taqman探针-1的摩尔比为6∶2∶3∶3；

所述引物组合d中87k-1引物、87k-2引物、下游引物-1、taqman探针-2的摩尔比为3∶1∶1∶1；

所述引物组合e中91n引物、91g引物、91y引物、下游引物-1、taqman探针-2的摩尔比为3∶1∶1∶1∶1；

所述引物组合f中上游引物-2、下游引物-2和外控探针的摩尔比为3∶3∶2。

在本发明中所述引物组合a和引物组合b用于幽门螺杆菌中cyp2c19的基因多态性的检测，引物组合c和引物组合f用于23srrna基因是否含有23srrna突变位点的检测、引物组合d、引物组合e和引物组合f用于gyra基因中是否含有n87k或d91g/y/n突变的检测，上述引物组合共同完成幽门螺杆菌个体化基因检测。

本发明进一步提供了一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr试剂，包括pcr试剂a、pcr试剂b、pcr试剂c、pcr试剂d、pcr试剂e和pcr试剂f，如下述1)、2)、3)、4)、5)和6)所示：

1)pcr试剂a由pcr扩增反应液、所述引物组合a、冻干保护剂和水组成；

2)pcr试剂b由pcr扩增反应液、所述引物组合b、冻干保护剂和水组成；

3)pcr试剂c由pcr扩增反应液、所述引物组合c、冻干保护剂和水组成；

4)pcr试剂d由pcr扩增反应液、所述引物组合d、冻干保护剂和水组成；

5)pcr试剂e由pcr扩增反应液、所述引物组合e、冻干保护剂和水组成；

6)pcr试剂f由pcr扩增反应液、所述引物组合f、冻干保护剂和水组成。

其中，所述冻干保护剂，由以下各原料制成：海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白和水。

所述冻干保护剂的制备方法为：称取海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入无菌水中，混匀，溶解。

其中，所述冻干保护剂中海藻糖的质量浓度为2％-10％；

所述冻干保护剂中甘露醇的质量浓度为1％-8％；

所述冻干保护剂中牛血清白蛋白的质量浓度为1％-8％。

本发明提供了arms-qpcr试剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述arms-qpcr试剂中pcr试剂a、pcr试剂b、pcr试剂c、pcr试剂d、pcr试剂e和pcr试剂f分别按照比例配制并混匀；

2)冷冻干燥，得到arms-qpcr试剂。

其中，所述冷冻干燥采用冷冻真空干燥，包括以下步骤：

1)预冷冻阶段：板层温度-35℃～-50℃，保持2-4h；

2)升华阶段：真空度达到60pa以下，-35℃～10℃保持3-8h；

3)解析干燥阶段：10℃～30℃保持1-6h。

本发明进一步提供一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr试剂盒，所述试剂盒包含以上arms-qpcr试剂。

本发明上述arms-qpcr引物组合物，arms-qpcr试剂或arms-qpcr试剂盒在制备用于幽门螺杆菌中cyp2c19的基因多态性的检测、23srrna基因是否含有23srrna突变位点的检测、gyra基因中是否含有n87k或d91g/y/n突变的检测的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于幽门螺杆菌个体化基因检测的方法，包括以下步骤：

用上述arms-qpcr引物组合物，arms-qpcr试剂或arms-qpcr试剂盒分别对待测样本进行arms-qpcr检测，得到扩增产物进行结果判读：

若a管和b管中fam/rox/cy5三个荧光通道均无扩增曲线且无ct值，或ct＞37，则该反应无效，需重新提取待测样本进行测试；

若a管和b管中fam/rox/cy5三个荧光通道两个扩增管中至少其中一个ct≤37，则按照下表判读结果：

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且c管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct≤7，则待测样本中幽门螺杆菌23srrna基因含有23srrna突变位点；

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且c管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct＞7，则待测样本中幽门螺杆菌23srrna基因不含有23srrna突变位点；

若f管扩增曲线为阴性或ct＞32，说明待测样本dna提取浓度过低或超出本方法检测范围，则需重新提取待测样本；

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且d管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct≤7，则待测样本中幽门螺杆菌gyra基因含有n87k突变；

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且e管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct≤7，则待测样本中幽门螺杆菌gyra基因含有d91g/y/n突变；

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，d管和e管无s型扩增曲线，或d管和e管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct＞7，则待测样本中幽门螺杆菌gyra基因不含n87k或d91g/y/n突变；

若f管扩增曲线为阴性或ct＞32，说明待测样本dna提取浓度过低或超出本方法检测范围，则需重新提取待测样本。

本发明的有益效果如下：

本发明基于arms-qpcr平台，针对人cyp2c19基因和幽门螺杆菌的23srrna基因和gyra基因的突变位点设计arms-qpcr引物，提高了扩增的特异性；本发明通过特异性的扩增核酸dna，从而可以对微量的模板进行富集，提高了检测的灵敏度，可以检测hp基因相关位点0.1-1％的突变和低至1ng的人cyp2c19基因的样本dna。

本发明的检测用试剂为冻干粉，能实现冷冻干燥，检测时操作简单，只需一步水化就能够实现检测目的，提高了试剂的稳定性，并且可以在常温下运输和/或保存。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出幽门螺杆菌阳性样本2的cyp2c19*2多态性位点的检测结果。

图2示出幽门螺杆菌阳性样本2的cyp2c19*3多态性位点的检测结果。

图3示出幽门螺杆菌阳性样本2的cyp2c19*17多态性位点的检测结果。

图4示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本1的23srrna基因的a2142g突变型的结果图。

图5示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本2的23srrna基因的a2143g突变型的结果图。

图6示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本3的23srrna基因的野生型的结果图。

图7示出幽门螺杆菌阳性样本23srrna基因a2142g突变型的测序结果。

图8示出幽门螺杆菌阳性样本23srrna基因a2143g突变型的测序结果。

图9示出幽门螺杆菌阳性样本23srrna基因野生型的测序结果。

图10示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本1的gyra基因的n87k突变型的结果图。

图11示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本2的gyra基因的d91g/y/n突变型的结果图。

图12示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本3的gyra基因的n87k野生型的结果图。

图13示出试剂盒检测幽门螺杆菌阳性样本3的gyra基因的d91g/y/n野生型的结果图。

图14示出液体试剂与冻干试剂复溶后检测幽门螺杆菌阳性样本2的23srrna基因的结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1用于幽门螺杆菌个体化基因检测的引物和探针

1、根据人cyp2c19基因三个位点的序列，设计并筛选特异性的引物和探针，用于检测cyp2c19基因多态性的情况，序列具体如下：

上游引物*2：5’-gatcaggaagcaatcaataaagtcc-3’(seqidno.1)

cyp2c19*2g引物：5’-tcccactatcattgattatttcccg-3’(seqidno.2)

cyp2c19*2a引物：5’-tcccactatcattgattatttcgta-3’(seqidno.3)

taqman探针*2：5’-fam-aatatcactttccataaaagcaaggt-bhq1-3’(seqidno.4)

上游引物*3：5’-tcaaaaatgtacttcagggct-3’(seqidno.5)

cyp2c19*3g引物：5’-caggattgtaagcaccccctag-3’(seqidno.6)

cyp2c19*3a引物：5’-gattgtaagcaccccctga-3’(seqidno.7)

taqman探针*3：5’-rox-tgaaaacatcaggattgtaagcac-bhq2-3’(seqidno.8)

上游引物*17：5’-cctgttttatgaacaggatgaa-3’(seqidno.9)

cyp2c19*17c引物：5’-attatctcttacatcagagatg-3’(seqidno.10)

cyp2c19*17t引物：5’-attatctcttacatcagagata-3’(seqidno.11)

taqman探针*17：5’-cy5-taactaatgtttggaagttgttttgtt-bhq2-3’(seqidno.12)

根据幽门螺杆菌的23srrna基因的突变位点的基因序列，设计并筛选特异性的突变引物和探针，用于检测幽门螺杆菌23srrna基因是否含有23srrna基因的突变位点，序列具体如下：

上游引物-1：5’-ctataacggtcctaaggtagcga-3’(seqidno.13)

taqman探针-1：5’-fam-aattcctcctacccgcggcaagac-bhq1-3’(seqidno.14)

a2142g突变型引物：5’-taaaggtccacggggtcacc-3’(seqidno.15)

a2143g突变型引物：5’-tagtaaaggtccacggggtcgc-3’(seqidno.16)

根据幽门螺杆菌的gyra基因的突变位点的基因序列，设计并筛选特异性的突变引物和探针，用于检测幽门螺杆菌gyra基因中是否含有n87k或d91g/y/n突变；

序列具体如下：

下游引物-1：5’-atttcttcactcgccttagtcattc-3’(seqidno.17)

taqman探针-2：5’-fam-tgagaatggcgcaagatttttccat-bhq13’(seqidno.18)

87k-1引物：5’-cacccccatggcgataaa-3’(seqidno.19)

87k-2引物：5’-cacccccatggcgatatg-3’(seqidno.20)

91n引物：5’-atggcgataatgcggtttcta-3’(seqidno.21)

91g引物：5’-atggcgataatgcggtttatag-3’(seqidno.22)

91y引物：5’-atggcgataatgcggtttact-3’(seqidno.23)

上游引物-2：5’-atttagcttattccatgagcgtgat-3’(seqidno.24)

下游引物-2：5’-gcgacttttgaagtaaggcctaatt-3’(seqidno.25)

外控探针：5’-fam-gctttaccggacgctagagatggct-bhq13’(seqidno.26)

实施例2用于幽门螺杆菌个体化基因检测的引物组合物

用于幽门螺杆菌个体化基因检测的引物组合物，为如下1)、2)、3)、4)、5)和6)：

1)引物组合a由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2g引物、cyp2c19*3g引物、cyp2c19*17c引物、taqman探针*2、taqman探针*3、taqman探针*17组成；

2)引物组合b由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2a引物、cyp2c19*3a引物、cyp2c19*17t引物、taqman探针*2、taqman探针*3、taqman探针*17组成；

3)引物组合c由上游引物-1、a2142g突变型引物、a2143g突变型引物、taqman探针-1组成；

4)引物组合d由87k-1引物、87k-2引物、下游引物-1、taqman探针-2组成；

5)引物组合e由91n引物、91g引物、91y引物、下游引物-1、taqman探针-2组成；

6)引物组合f由上游引物-2、下游引物-2和外控探针组成。

实施例3用于幽门螺杆菌个体化基因检测的pcr试剂及检测试剂盒的制备

1、用于幽门螺杆菌个体化基因检测的pcr试剂

用于幽门螺杆菌个体化基因检测的pcr试剂，为如下1)、2)、3)、4)、5)和6)：

1)pcr试剂a由pcr扩增反应液、所述引物组合a、冻干保护剂和水组成；

2)pcr试剂b由pcr扩增反应液、所述引物组合b、冻干保护剂和水组成；

3)pcr试剂c由pcr扩增反应液、所述引物组合c、冻干保护剂和水组成；

4)pcr试剂d由pcr扩增反应液、所述引物组合d、冻干保护剂和水组成；

5)pcr试剂e由pcr扩增反应液、所述引物组合e、冻干保护剂和水组成；

6)pcr试剂f由pcr扩增反应液、所述引物组合f、冻干保护剂和水组成。

2、检测试剂盒的制备

2.1冻干保护剂的配制

称取5g海藻糖、2.5g甘露醇和1.2g牛血清白蛋白加入100ml无菌水中，混匀，溶解。

2.2pcr试剂的配制

pcr试剂a反应体系，由pcr扩增反应液12.5μl、上游引物*20.75μl(终浓度0.3μm)、上游引物*30.75μl(终浓度0.3μm)、上游引物*170.5μl(终浓度0.2μm)、cyp2c19*2g引物0.75μl(终浓度0.3μm)、cyp2c19*3g引物0.75μl(终浓度0.3μm)、cyp2c19*17c引物0.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针*20.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针*30.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针*170.25μl(终浓度0.1μm)，上述冻干保护剂2μl，用水将体系补至23μl。

pcr试剂b反应体系，由pcr扩增反应液12.5μl、上游引物*20.75μl(终浓度0.3μm)、上游引物*30.75μl(终浓度0.3μm)、上游引物*170.5μl(终浓度0.2μm)、cyp2c19*2a引物0.75μl(终浓度0.3μm)、cyp2c19*3a引物0.75μl(终浓度0.3μm)、cyp2c19*17t引物0.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针*20.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针*30.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针*170.25μl(终浓度0.1μm)，上述冻干保护剂2μl，用水将体系补至23μl。

pcr试剂c反应体系，由pcr扩增反应液12.5μl、上游引物-11.5μl(终浓度0.6μm)、a2142g突变型引物0.75μl(终浓度0.3μm)、a2143g突变型引物0.75μl(终浓度0.3μm)、taqman探针-10.5μl(终浓度0.2μm)，上述冻干保护剂2μl，用水将体系补至23μl。

pcr试剂d反应体系，由pcr扩增反应液12.5μl、下游引物-11.5μl(终浓度0.6μm)、87k-1引物0.5μl(终浓度0.2μm)、87k-2引物0.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针-20.5μl(终浓度0.2μm)，上述冻干保护剂2μl，用水将体系补至23μl。

pcr试剂e反应体系，由pcr扩增反应液12.5μl、下游引物-11.5μl(终浓度0.6μm)、91n引物0.5μl(终浓度0.2μm)、91g引物0.5μl(终浓度0.2μm)、91y引物0.5μl(终浓度0.2μm)、taqman探针-20.5μl(终浓度0.2μm)，上述冻干保护剂2μl，用水将体系补至23μl。

pcr试剂f反应体系，由pcr扩增反应液12.5μl、上游引物-21μl(终浓度0.4μm)、下游引物-21μl(终浓度0.4μm)、外控探针0.5μl(终浓度0.2μm)，上述冻干保护剂2μl，用水将体系补至23μl。

pcr反应总体积为25μl，含23μl的反应体系和2μl的检测模板。

2.3pcr试剂的冷冻干燥

将配制好的pcr试剂a-pcr试剂f放入冻干机中，板层温度-35℃～-50℃下保持2-4h，真空度达到60pa以下，-35℃～10℃保持3-8h，然后10℃～30℃保持1-6h，最终得到冻干试剂。

2.4试剂盒组成

试剂盒采用8联pcr管设计，每一个8联管检测一个样品，试剂盒组成成分如下：

1)八联pcr反应管：a-f号管为pcr冻干试剂a-f，g和h号管为空管；

2)阳性质控品：人工合成的质粒混合冻干粉。

实施例4试剂盒检测方法

1.样本基因组dna提取

从人胃黏膜组织样本中提取dna，推荐使用商业化的提取试剂盒进行样本1-3的提取；

提取的dna需用紫外分光光度计测定浓度，其dna的od260/od280在1.8-2.0，提取完的dna建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存。

2.pcr检测

用23μl纯化水将pcr冻干试剂a-f复溶，然后分别加入2μl的提取dna，样本1-3均分别在a-f号管中进行反应。

pcr扩增程序为：50℃udg酶反应2min，95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火延伸45s，40个循环，60℃时收集荧光。

3.结果判读

1)人cyp2c19基因多态性的判读

参照附图：图1、图2、图3。

若a管和b管中fam/rox/cy5三个荧光通道均无扩增曲线且无ct值，或ct＞37，则该反应无效，需重新提取样本进行测试。

若a管和b管中fam/rox/cy5三个荧光通道两个扩增管中至少其中一个ct≤37，(靶基因通道无扩增曲线，ct值按40计算)，则按照下表判读结果：

2)hp23srrna基因突变情况的判读

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且c管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct≤7，则待测样本中幽门螺杆菌23srrna基因含有23srrna突变位点；参照图4的δct＝3、图5的δct＝0.5。

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且c管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct＞7，则待测样本中幽门螺杆菌23srrna基因不含有23srrna突变位点；参照图6的δct＝12。

若f管扩增曲线为阴性或ct＞32，说明样本dna提取浓度过低或超出本方法检测范围，建议重新提取样本。

本试剂盒的检测结果与对应样本的测序结果一致，测序结果见图7、图8、图9。

3)hpgyra基因突变情况的判读

参照附图：图10、图11、图12、图13。

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且d管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct≤7，则待测样本中幽门螺杆菌gyra基因含有n87k突变；

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，且e管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct≤7，则待测样本中幽门螺杆菌gyra基因含有d91g/y/n突变；

若f管有扩增s型曲线且ct≤32，d管和e管无s型扩增曲线，或d管和e管有s型扩增曲线且其与f管的扩增曲线δct＞7，则待测样本中幽门螺杆菌gyra基因不含n87k或d91g/y/n突变；

若f管扩增曲线为阴性或ct＞32，说明样本dna提取浓度过低或超出本方法检测范围，建议重新提取样本。

实施例5试剂盒的临床应用

本实施例中收集临床病理诊断为幽门螺杆菌阳性的50例患者的胃黏膜组织块，并从中提取基因组dna。用个体化基因检测试剂盒检测样本，具体步骤如下：

1.样本基因组dna提取

胃黏膜组织样本的提取使用商业化的提取试剂盒，按说明书进行提取待检测样本基因组dna，将抽提好的dna样本，用紫外分光光度计测定浓度和dna质量，dna的浓度要求大于10ng/μl，dna的质量od260/od280在1.8-2.0之间。

2.荧光pcr检测

按实施例4的2方法和3判读中方法进行检测。

3.结果统计

胃黏膜样本中，均可对人cyp2c19基因对应多态性位点进行准确分型，其结果与测序结果的符合率高达99％以上。

幽门螺杆菌阳性样本中，6例检测出含有23srrna基因a2142g或a2143g突变，其中突变型或野生型与测序结果一致。上述野生型样本和突变型样本与药敏实验结果对照，结果突变型样本克拉霉素耐药，野生型样本克拉霉素敏感。

幽门螺杆菌阳性样本中，5例检测出含有gyra基因第87位或第91位氨基酸突变，其中突变型或野生型与测序结果一致。上述野生型样本和突变型样本与药敏实验结果对照，结果突变型样本左氧氟沙星耐药，野生型样本左氧氟沙星敏感。

另外，本发明比较了冻干试剂和液体试剂对对幽门螺杆菌阳性样本的检测效果，结果证明，冻干试剂复溶后对幽门螺杆菌阳性样本的检测效果与液体试剂的检测效果相当，见附图14。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

sequencelisting

<110>孙晓彦

<120>用于幽门螺杆菌个体化基因检测的arms-qpcr方法和试剂盒

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<212>dna

<213>人工合成下游引物-1

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atggcgataatgcggtttact21

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<213>人工合成上游引物-2

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<213>人工合成下游引物-2

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gcgacttttgaagtaaggcctaatt25

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<211>25

<212>dna

<213>人工合成外控探针

<400>26

gctttaccggacgctagagatggct25