本发明涉及一种从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法，属于生化分离技术领域。
背景技术：
长链高级烷烃(c12-c16)具有较高的logp值(6.6-8.8),因此对细胞的毒性作用较小，有较好的生物相容性，常用来做植物细胞、微生物细胞的两相培养溶剂。有许多学者研究利用长链高级烷烃为有机相，进行紫草毛状根两相培养生产紫草素、东北红豆杉两相培养生产紫杉醇、杜氏盐藻两相培养生产类胡萝卜素等，能够有效地将代谢产物从细胞中转移至有机相，并加快代谢产物的释放速率，同时对细胞生长抑制作用非常小。
长链高级烷烃(c12-c16)对许多脂溶性活性产物都有较好的萃取发酵效果，但是其沸点较高，例如正十二烷的沸点高达215℃，这导致不能利用水浴的真空浓缩去除发酵产物萃取液中的长链高级烷烃溶剂而得到活性产物，采用温度较高的油浴真空浓缩会使热敏性成分分解，而且存在安全隐患；利用乙醇等溶剂萃取长链高级烷烃也不能得到良好的效果，要消耗大量乙醇，萃取率较低，萃取后的十二烷烃中活性成分残余较多，而且乙醇中仍然会溶解部分十二烷烃。
技术实现要素：
本发明是为了解决难以从含有长链高级烷烃的发酵产物萃取液中提取活性成分的问题而进行的，目的在于提供一种从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法。
本发明采用了以下技术方案：
本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将牛樟芝发酵产物萃取液与有机溶剂按体积比5:1-1:3的比例进行混合，并搅拌萃取得到混合液。
步骤二，将混合液置于低温环境中，搅拌20-60min，搅拌速率为50-200rpm，得到冰晶。
步骤三，在低温环境下，将冰晶压榨去除，得到剩余溶液。
步骤四，将剩余溶液重复步骤二以及步骤三直至无冰晶生成为止，得到最终溶液。
步骤五，将最终溶液进行低温真空浓缩，去除有机溶剂，所得膏状物即为活性成分。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，牛樟芝发酵产物包括牛樟芝谷物固态发酵产物以及牛樟芝原位萃取发酵产物。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，萃取液中的萃取剂为碳原子个数为12-16的长链高级烷烃。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，活性成分包括麦角甾醇、安卓奎诺尔、不饱和脂肪酸。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤一中，有机溶剂为丙酮、乙醇或甲醇中的任意一种或任意两种及以上的混合溶剂。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤一中，搅拌萃取的搅拌速率为300rpm，搅拌时间为30min。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤二中，低温的温度范围为-10-0℃。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤三中，低温的温度为0℃。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征，在步骤一之前，还包括预处理步骤：将牛樟芝发酵产物萃取液5000rpm离心，去除固形杂质以及残余水分。
在本发明提供的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法中，还可以具有这样的特征其特征在于，在步骤五之后，还包括萃取剂回收利用步骤：将冰晶融化处理得到含有萃取剂的溶液，将该溶液继续利用来进行牛樟芝发酵产物萃取液的生产、制备。
发明的作用与效果
本发明所涉及的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法，利用冷冻浓缩的原理，将牛樟芝发酵产物中的活性成分从牛樟芝发酵产物的长链高级烷烃萃取液中提取出来，与现有技术相比具有以下优点：分离提取的方法简单，活性成分提取率高达90％以上，克服了高温提取破坏活性成分的活性的缺点，特别适用于热敏性活性成分的提取分离，产品质量容易控制，避免了高温操作，安全可靠，容易实现工业化生产。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例对本发明从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法作具体阐述。
实施例1
牛樟芝谷物固态发酵产物的萃取分离
在本实施例中，牛樟芝谷物为牛樟芝青稞。
步骤一，取50g牛樟芝青稞固态发酵产物粉末，加入十二烷烃500ml，50℃搅拌萃取1h，萃取结束后抽滤，获得牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液，5000rpm离心去除固形杂质以及残余水分。
步骤二，将牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液与丙酮按体积比5:1的比例进行混合，并搅拌萃取，搅拌速率为300rpm，萃取时间为30min，得到混合液。
步骤三，将混合液置于-10℃环境中，搅拌20min，搅拌速率为50rpm。
步骤四，在0℃环境下，将混合溶液中的冰晶迅速压榨去除，得到剩余溶液。
步骤五，将剩余溶液重复步骤二以及步骤三直至无冰晶生成为止，得到最终溶液。
步骤六，将最终溶液进行低温真空浓缩，去除丙酮，所得膏状物即为活性成分。
步骤七，将冰晶融化处理得到含有十二烷烃的溶液，将该溶液继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
根据本实施例的分离纯化方法，牛樟芝青稞固态发酵的活性成分麦角甾醇、安卓奎诺尔antroquinonol、不饱和脂肪酸的提取率达到90％，回收的十二烷烃溶液为无色无味液体，能够继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
实施例2
牛樟谷物稞固态发酵产物的萃取分离
在本实施例中，牛樟芝谷物为牛樟芝青稞。
步骤一，取50g牛樟芝青稞固态发酵产物粉末，加入十二烷烃500ml，50℃搅拌萃取1h，萃取结束后抽滤，获得牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液，5000rpm离心去除固形杂质以及残余水分。
步骤二，将牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液与丙酮按体积比1:1的比例进行混合，并搅拌萃取，搅拌速率为300rpm，萃取时间为30min，得到混合液。
步骤三，将混合液置于-6℃环境中，搅拌40min，搅拌速率为90rpm。
步骤四，在0℃环境下，将混合溶液中的冰晶迅速压榨去除，得到剩余溶液。
步骤五，将剩余溶液重复步骤二以及步骤三直至无冰晶生成为止，得到最终溶液。
步骤六，将最终溶液进行低温真空浓缩，去除丙酮，所得膏状物即为活性成分。
步骤七，将冰晶融化处理得到含有十二烷烃的溶液，将该溶液继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
根据本实施例的分离纯化方法，牛樟芝青稞固态发酵的活性成分麦角甾醇、安卓奎诺尔antroquinonol、不饱和脂肪酸的提取率达到97％，回收的十二烷烃溶液为无色无味液体，能够继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
实施例3
牛樟芝谷物固态发酵产物的萃取分离
在本实施例中，牛樟芝谷物为牛樟芝青稞。
步骤一，取50g牛樟芝青稞固态发酵产物粉末，加入十二烷烃500ml，50℃搅拌萃取1h，萃取结束后抽滤，获得牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液，5000rpm离心去除固形杂质以及残余水分。
步骤二，将牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液与丙酮按体积比1:3的比例进行混合，并搅拌萃取，搅拌速率为300rpm，萃取时间为30min，得到混合液。
步骤三，将混合液置于0℃环境中，搅拌60min，搅拌速率为200rpm。
步骤四，在0℃环境下，将混合溶液中的冰晶迅速压榨去除，得到剩余溶液。
步骤五，将剩余溶液重复步骤二以及步骤三直至无冰晶生成为止，得到最终溶液。
步骤六，将最终溶液进行低温真空浓缩，去除丙酮，所得膏状物即为活性成分。
步骤七，将冰晶融化处理得到含有十二烷烃的溶液，将该溶液继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
根据本实施例的分离纯化方法，牛樟芝青稞固态发酵的活性成分麦角甾醇、安卓奎诺尔antroquinonol、不饱和脂肪酸的提取率达到93％，回收的十二烷烃溶液为无色无味液体，能够继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
实施例4
牛樟芝谷物固态发酵产物的萃取分离
在本实施例中，牛樟芝谷物为牛樟芝青稞。
步骤一，取50g牛樟芝青稞固态发酵产物粉末，加入十四烷烃500ml，50℃搅拌萃取1h，萃取结束后抽滤，获得牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液，5000rpm离心去除固形杂质以及残余水分。
步骤二，将牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液与乙醇按体积比1:1的比例进行混合，并搅拌萃取，搅拌速率为300rpm，萃取时间为30min，得到混合液。
步骤三，将混合液置于-6℃环境中，搅拌40min，搅拌速率为90rpm。
步骤四，在0℃环境下，将混合溶液中的冰晶迅速压榨去除，得到剩余溶液。
步骤五，将剩余溶液重复步骤二以及步骤三直至无冰晶生成为止，得到最终溶液。
步骤六，将最终溶液进行低温真空浓缩，去除丙酮，所得膏状物即为活性成分。
步骤七，将冰晶融化处理得到含有十四烷烃的溶液，将该溶液继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
根据本实施例的分离纯化方法，牛樟芝青稞固态发酵的活性成分麦角甾醇、安卓奎诺尔antroquinonol、不饱和脂肪酸的提取率达到95％，回收的十四烷烃溶液为无色无味液体，能够继续利用来进行牛樟芝青稞固态发酵产物的萃取液的制备。
实施例5
牛樟芝十二烷烃原位萃取发酵产物的萃取分离
步骤一，将牛樟芝十二烷烃原位萃取发酵液中的萃取液取出，即为牛樟芝发酵产物萃取液，量取100ml，5000rpm离心去除固形杂质以及残余水分。
步骤二，将牛樟芝发酵产物萃取液与丙酮按体积比1:1的比例进行混合，并搅拌萃取，搅拌速率为300rpm，萃取时间为30min，得到混合液。
步骤三，将混合液置于-6℃环境中，搅拌40min，搅拌速率为90rpm。
步骤四，在0℃环境下，将混合溶液中的冰晶迅速压榨去除，得到剩余溶液。
步骤五，将剩余溶液重复步骤二以及步骤三直至无冰晶生成为止，得到最终溶液。
步骤六，将最终溶液进行低温真空浓缩，去除丙酮，所得膏状物即为活性成分。
步骤七，将冰晶融化处理得到含有十二烷烃的溶液，将该溶液继续利用来进行牛樟芝十二烷烃原位萃取发酵液的萃取液的制备。
根据本实施例的分离纯化方法，牛樟芝十二烷烃原位萃取发酵的活性成分麦角甾醇、安卓奎诺尔antroquinonol、不饱和脂肪酸的提取率达到97％，回收的十二烷烃为无色无味液体，能够继续用于牛樟芝十二烷烃原位萃取发酵液的萃取液的制备。
实施例的作用与效果
本发明所涉及的从牛樟芝发酵产物萃取液中提取活性成分的方法，利用冷冻浓缩的原理，将牛樟芝发酵产物中的活性成分从牛樟芝发酵产物的长链高级烷烃萃取液中提取出来，与现有技术相比具有以下优点：分离提取的方法简单，活性成分提取率高达90％以上，克服了高温提取破坏活性成分的活性的缺点，特别适用于热敏性活性成分的提取分离，产品质量容易控制，避免了高温操作，安全可靠，容易实现工业化生产。
更进一步地，可以同时回收高级烷烃萃取剂，回收的高级烷烃萃取剂无色无味说明其中的发酵产物含量极低，可以重复使用，从而降低生产成本，使发酵产物中的活性成分易于大规模工业生产。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。