海洋真菌提取物、制备方法及应用与流程

本发明涉及真菌提取物领域，尤其涉及一种海洋真菌提取物、制备方法及应用。

背景技术：

植物病害严重危害农业生产，每年造成巨大的经济损失。据联合国粮农组织(fao)统计，每年农作物因遭受病害造成的减产损失平均为总产量的10％～15％。其中，植物细菌病害带来的问题尤为严重，随着农用硫酸链霉素的停用，极为缺乏有效的防治药剂，而铜制剂等防治效果一般，且属于化学农药，易造成环境污染和食品安全问题，同时还会造成病原菌抗药性的出现。因此研发新型环境友好型高效低毒生物农药用来防治植物细菌病害成为迫在眉睫的课题。

海洋真菌由于能够产生结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物而引起了人们的关注。自2007年以来，每年从海洋真菌中获得的新化合物数目在100个以上，仅2015年，就报道了400多个新的海洋真菌次级代谢产物。这些化合物当中很多都具有诸如抗菌、抗炎、抗癌、酶抑制等显著地生物活性。

然而目前对于海洋真菌次级代谢产物的活性研究大多集中于人类医学方面，对于其在农业方面的应用很少，特别是在防治植物病原细菌方面，文献调研发现，目前并没有对于海洋真菌次级代谢产物防治植物细菌病害的报道。因此从海洋真菌中获得具有抗植物病原细菌活性的化合物具有十分广阔的发展前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种海洋真菌提取物、制备方法及应用，该海洋真菌提取物具有抗植物病原细菌活性，作为杀菌剂应用可用来预防和治疗植物病原细菌引起的植物病害。

本发明一方面提供了一种海洋真菌提取物，该海洋真菌提取物提取自海洋真菌fusariumequisetigly27,所述海洋真菌fusariumequisetigly27的保藏号是cgmcc14348。

本发明另一方面提供了上述海洋真菌提取物的制备方法，包括以下步骤：

在菌种培养基中进行对海洋真菌fusariumequisetigly27培养，转入发酵培养基中进行发酵，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得海洋真菌提取物。

作为优选技术方案，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，在菌种培养基中28℃培养5-7天。

作为优选技术方案，所述马铃薯葡萄糖平板培养基配比为：马铃薯5-6g/l、葡萄糖15-20g/l、琼脂18-20g/l，其余为去离子水。

作为优选技术方案，所述发酵培养基为大米固体培养基，500ml锥形瓶中加入大米40g，水30ml，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。

作为优选技术方案，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2次，随后用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡2次。

本发明的再一方面提供了上述海洋真菌提取物的应用，所述海洋真菌提取物用于预防和治疗由植物病原细菌引起的植物病害。

作为优选技术方案，所述植物病原细菌为丁香假单胞杆菌p.syringae、燕麦食酸菌a.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌e.carotovora和密执安棍状杆菌c.michiganensis。

本发明的又一方面提供了一种植物病原细菌杀菌剂，其有效成分为上述海洋真菌提取物，还包括溶剂或助剂。

作为优选技术方案，所述植物病原细菌杀菌剂为所述海洋真菌提取物溶解于二甲基亚砜制得，海洋真菌提取物的浓度为0.1-1.0mg/ml。

与现有技术相比，本发明所具有的优势及有益效果在于：

1、本发明首次发现了海洋真菌fusariumequisetigly27发酵粗提物的抗植物病原细菌活性，杀菌活性高、效果好，低浓度下可发挥优异的杀菌性能；

2、本发明的海洋真菌提取物，可作为农用杀菌剂主要成分用来预防和治疗植物病原细菌引起的病害，并且对由丁香假单胞杆菌p.syringae、燕麦食酸菌a.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌e.carotovora和密执安棍状杆菌c.michiganensis引起的植物细菌病害防治效果显著；

3、本发明的海洋真菌提取物可以通过真菌发酵进行大规模生产，成本低，制备效率高，不受资源限制，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的海洋真菌提取物(1.0mg/ml)、阳性对照药剂、阴性对照药剂对4种植物病原细菌的抗菌效果图；

图2为本发明实施例所提供的海洋真菌提取物(0.1mg/ml)和阳性对照药剂对2种植物病原细菌的抗菌效果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一实施例提供了一种海洋真菌提取物，该海洋真菌提取物提取自海洋真菌fusariumequisetigly27，所述海洋真菌fusariumequisetigly27的保藏号是cgmcc14348。该海洋真菌为木贼镰刀菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年7月3日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的另一实施例提供了海洋真菌提取物的制备方法，包括以下步骤：在菌种培养基中进行对海洋真菌fusariumequisetigly27培养，转入发酵培养基中进行发酵，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得海洋真菌提取物。本步骤中，海洋真菌经过菌种活化和发酵扩大培养后能够产生代谢产物，利于提取物的制备，发酵后的发酵产物经过乙酸乙酯浸泡，再经过甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，能够充分提取其中的次级代谢产物。乙酸乙酯的萃取能够保证提取物活性的基础上进行浓缩和提纯。

在一优选的实施例中，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，在菌种培养基中28℃培养5-7天；其中，马铃薯葡萄糖平板培养基配比为：马铃薯5-6g/l、葡萄糖15-20g/l、琼脂18-20g/l，其余为去离子水。本实施例中，可以理解的是，菌种的培养温度可以在28℃左右，培养的时间可以根据培养的情况进行略微调整。培养基中马铃薯和葡萄糖的配比是针对fusariumequiseti进行了优化和选择的，能够有效的促进fusariumequiseti的生长。

在一优选的实施例中，所述发酵培养基为大米固体培养基，500ml锥形瓶中加入大米40g，水30ml，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。本实施例中，可以理解的是，菌种的发酵温度可以在28℃左右，具体发酵的时间可以根据发酵的情况进行缩短或延长。发酵培养基中大米的浓度是针对fusariumequisetigly27进行了优化和选择的，能够有效的促进fusariumequisetigly27的菌丝生长和次生代谢产物的产生。

在一优选的实施例中，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2次，随后用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡2次。本实施例中，浸泡2次能够充分提取，可以理解的是，浸泡多次也可以充分提取，但是比较费时。

本发明的再一实施例为上述海洋真菌提取物的应用，上述海洋真菌提取物用于预防和治疗由植物病原细菌引起的植物病害。本实施例中，上述海洋真菌提取物对于植物病原细菌引起的植物细菌病害疗效显著。其中，针对丁香假单胞杆菌p.syringae、燕麦食酸菌a.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌e.carotovora和密执安棍状杆菌c.michiganensis引起的植物病害防治疗效特别显著。具体的，本发明的上述海洋真菌提取物可主要用来预防和治疗由丁香假单胞杆菌p.syringae引起的角斑病，燕麦食酸菌a.avenae引起的果斑病，胡萝卜软腐欧文氏菌e.carotovora引起的软腐病和密执安棍状杆菌c.michiganensis引起的溃疡病。

本发明的又一实施例提供了一种植物病原细菌杀菌剂，其有效成分为上述海洋真菌提取物，还包括溶剂或助剂。本实施例中，以上述海洋真菌提取物为有效成分，可配合其他的溶剂或助剂配制成为具有优异杀菌效果的杀菌剂。其中溶剂可以为能够有效溶解上述海洋真菌提取物的任意溶剂，助剂包括能够促进该海洋真菌提取物发挥杀菌作用的有效助剂以及在具体施用杀菌剂过程中促进施用效果的有效助剂，另外，本领域常见的杀菌剂配合助剂也可用于本发明的植物病原杀菌剂中，例如表面活性剂、分散剂、润湿剂、增稠剂、消泡剂、填料等。

在一优选的实施例中，所述植物病原细菌杀菌剂为所述海洋真菌提取物溶解于二甲基亚砜制得，海洋真菌提取物的浓度为0.1-1.0mg/ml。本实施例中，所述植物病原细菌杀菌剂的浓度可以为上述浓度范围内的任意取值，具体应用过程中可以根据病原细菌引起的病害程度以及实施方式具体选择上述的浓度，例如，可以选择的浓度可以为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mg/ml。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的海洋真菌提取物、制备方法及应用，以下将结合具体实施例进行说明。

实施例1海洋真菌fusariumequisetigly27的培养和发酵

海洋真菌fusariumequisetigly27的菌种培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，含有马铃薯5-6g/l、葡萄糖15-20g/l、琼脂18-20g/l，其余为水，使用时制成平板培养基，菌株在28℃下培养5-7天；

(2)海洋真菌fusariumequisetigly27的发酵培养采用大米固体培养基，每500ml锥形瓶中加入大米40g，水30ml，发酵3瓶，真菌菌株于28℃下培养30-40天。

实施例2海洋真菌提取物的制备

将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2遍，再用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得海洋真菌提取物。

实施例3海洋真菌提取物抗菌活性测定

测试对6株植物病原细菌：丁香假单胞杆菌p.syringae、燕麦食酸菌a.avenae、稻生黄单胞菌xanthomonasoryzae、胡萝卜软腐欧文氏菌e.carotovora、密执安棍状杆菌c.michiganensis和青枯雷尔氏菌ralstoniasolanacearum的抗菌活性。

上述6株植物病原细菌经lb培养基120rpm/min震荡培养24h。取细菌培养液制备菌悬液，调整菌液浓至2-5×10⁵cfu/ml，分别取菌悬液各0.1ml于平板培养基上，涂布均匀。

菌悬液稍干后，用无菌打孔器在离培养基边缘3cm处打取3个直径为3mm的小孔，3个小孔呈等边三角形排列。

将实施例2的海洋真菌提取物用二甲基亚砜(dmso)溶解，配制成1.0和0.1mg/ml的溶液，在小孔中加入15μl的上述溶液，37℃培养24h，测量抑菌圈大小，并与阳性对照药剂(同等浓度的硫酸链霉素)和阴性空白药剂(dmso)对比。

结果表明，参见图1，从左至右，分别为对p.syringae；a.avenae；e.carotovora；c.michiganensis的抑菌效果图。图(a)说明在1.0mg/ml的浓度下，本发明的海洋真菌提取物对4种植物病原细菌丁香假单胞杆菌p.syringae、燕麦食酸菌a.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌e.carotovora和密执安棍状杆菌c.michiganensis具有明显的抑菌活性。图(b)为阳性对照药剂，1.0mg/ml硫酸链霉素对p.syringae；a.avenae；e.carotovora；c.michiganensis的抑菌效果图，同等浓度下阳性药剂也具有杀菌效果；图(c)为阴性对照药剂(dmso)处理效果，同等条件下不存在抑菌圈。

参见图2，从左至右依次为：本发明的海洋真菌提取物对p.syringae的抗菌效果；硫酸链霉素对p.syringae的抗菌效果；本发明的海洋真菌提取物对a.avenae的抗菌效果；硫酸链霉素对a.avenae的抗菌效果。本发明的海洋真菌提取物对e.carotovora的抗菌效果；硫酸链霉素对e.carotovora的抗菌效果。图2的结果表明，当浓度在0.1mg/ml时，本发明的海洋真菌提取物对p.syringae和a.avenae的抑菌活性强于阳性药硫酸链霉素，对e.carotovora的抑菌活性与阳性药硫酸链霉素相当。上述试验充分说明本发明的海洋真菌提取物对于上述细菌抗菌活性优异，相比现有的抗细菌药剂，低浓度下能够取得显著的抗菌效果。