本发明涉及一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体，属于酶工程、生物工程领域。
背景技术：
丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase,pdc)是一种焦磷酸硫胺素(thiamindiphosphate,tpp)依赖性的非氧化酶，在tpp、mg2+的辅助作用下，它能使α-酮基羧酸脱羧，进而与醛类发生聚合反应，生成手性的α-羟基酮类化合物。α-羟基酮类化合物是一类重要的有机合成中间体，在制药工业上发挥着重要的作用，它进一步还原可生成邻二醇的结构，氧化可生成邻二酮，还原氨化可生成醇胺等许多药物，例如维生素e、抗真菌药sch42427、麻黄碱，都是通过α-羟基酮类化合物合成的。
丙酮酸脱羧酶在自然界中广泛存在，迄今研究较多的是酵母和运动单胞菌的pdc。不同来源的pdc性质都有所不同，尤其是因此而生成的不同构型的α-枪击酮类化合物更为引人注意。譬如，以乙醛酸，乙醛为底物，由酵母pdc催化合成的乳醛酸以r型为主，而由移动单胞pdc催化则以s型为主，而丙酮酸与芳香醛或杂环醛的缩合反应，用以上两种丙酮酸脱羧酶催化，生成的产物都以r型为主，且r构型能占97％以上。因此，不同来源的酶作为生物催化剂在合成不同构型的手性化合物中有着非常重要的意义。
由于野生型菌株的丙酮酸脱羧酶产量低，利用基因工程技术将丙酮酸脱羧酶克隆到大肠杆菌中，获得了丙酮酸脱羧酶的高效表达，利用基因工程菌产丙酮酸脱羧酶已成为一个重要的来源。
技术实现要素：
本发明通过定点突变技术来改变蛋白质分子的疏水性，从而进一步提高了丙酮酸脱羧酶的酶活，并应用于催化2-酮基-l-古龙酸产l-木糖，从而提高木糖转化率。
本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的丙酮酸脱羧酶突变体，所述突变是对氨基酸序列如seqidno.1所示的来源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，从而提高丙酮酸脱羧酶的活性。
所述突变是将丙酮酸脱羧酶的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸的突变体v176y。
丙酮酸脱羧酶突变体v176y的氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明解决的另一个技术问题是提供构建所述突变体的方法，是通过定点突变技术将丙酮酸脱羧酶蛋白质分子内部第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将含有编码丙酮酸脱羧酶的基因与载体pet22b(+)连接，转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，挑选转化子接种到lb液体培养基中，37℃培养10h，转接到tb培养基，接种量为1％，菌体长到od600为0.8时，加入iptg诱导，并将培养温度降到28℃，培养24h，收集菌体，进行破碎，离心，将破壁上清液进行纯化，得到丙酮酸脱羧酶的突变体。
本发明还提供了一株丙酮酸脱羧酶活力增加的大肠杆菌，是将含有编码丙酮酸脱羧酶的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
本发明还提供了一种提高丙酮酸脱羧酶活力的方法，是将氨基酸序列如seqidno.1所示的丙酮酸脱羧酶蛋白质分子内部的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。
本发明通过定点突变的方式，将丙酮酸脱羧酶分子内部亲水性氨基酸缬氨酸突变为输水性强的酪氨酸，改变分子内部疏水性，提高了菌株表达丙酮酸脱羧酶的活力，并将丙酮酸脱羧酶酶活提高了67％。改造后的酶用来催化2-酮基-l-古龙酸，l-木糖的转化效率提高31％，更适合工业应用，不仅降低成本，也可提高生产效率。
附图说明
图1突变体酶活
具体实施方式
lb培养基：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠10g/l，ph7.0。
tb培养基：蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油8g/l，17mmol/lkh2po4，72mmol/lk2hpo4。
采用分光光度法测定酿酒酵母中丙酮酸脱羚酶活性：在25℃和ph6.0的条件下测定反应液5min内在波长340nm处每分钟吸光度值的变化。以在25℃和ph6.0的条件下每分钟转化1.0μmol丙酮酸生成乙醛定义为以单位酶活。
实施例1：丙酮酸脱羧酶表达菌株的构建
根据genebank中酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因序列设计引物，如下：
上游引物：catgccatggattcaattactttgggtaaatatttgttcg
下游引物：ccgctcgagttgcttagcgttggtagcagcagtc
将丙酮酸脱羧酶的pcr产物插入到质粒pet-22b后，构建重组表达质粒pet-22b-pdc。
取0.01g重组表达质粒pet-22b-pdc转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞后，在600μl的lb培养基中培养1h，取100μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的固体lb平板，37℃培养10h，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序，从而获得可以高效表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌。
实施例2：丙酮酸脱羧酶表达菌株的验证
将实施例1中测序正确的菌株接种在lb液体培养基中，37℃培养10h，以1％的接种量接种到tb培养基中，待菌体长到od600为0.8时，加入iptg诱导，30℃下继续培养13h，离心收集菌体细胞，用磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，10000×离心20min，上清即为丙酮酸脱羧酶酶液，利用酶活检测方法，测得比酶活为15.3u/mg蛋白。
实施例3：高活性及其热稳定突变株的获得
利用定点突变试剂盒，设计引物如下:
f:aactagccagctaacttg
r:caagtcgaccaagttagc
以已构建的质粒pet-22b-pdc为模板，进行pcr，将丙酮酸脱羧酶的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。pcr条件为：95℃5min，30个循(95℃5min、55℃30s、72℃7min)，72℃10min。pcr扩增体系：模板1μl，上下游引物各1μl，2×primstarbuffer25μl，ddh2o22μl。采用胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收。转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pet-22b-pdc-v176y。
实施例4：高产丙酮酸脱羧酶生产菌株的验证
将实施例3中测序正确的菌株接种在lb液体培养基中，37℃培养10h，以1％的接种量接种到tb培养基中，待菌体长到od600为0.8时，加入iptg诱导，30℃下继续培养13h，离心收集菌体细胞，用磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，10000×离心20min，上清即为丙酮酸脱羧酶酶液，利用酶活检测方法，测得比酶活为25.5u/mg蛋白，较出发菌株提高67％。
实施例5：丙酮酸脱羧酶突变体催化2-酮基-l-古龙酸产l-木糖
反应体系包含2mg丙酮酸脱羧酶，5mm氯化镁，1mm焦磷酸硫胺素和1％的2-酮基-l-古龙酸溶解于50mm的ph5.8的柠檬酸缓冲液中，将反应体系放置于50℃条件下反应15h。反应结束后，离心去除不溶物，并将上清过0.22mm滤膜，所得的反应液采用高效液相色谱法进行检测，木糖含量的分析使用aminexhpx-87h色谱柱，色谱条件:柱温：40℃；流动相：5mm/lh2so4；进样量：10μl；检测器：rid；流速：0.5ml/min。检测到同样的条件下，突变酶较原始酶，木糖的转化率提高31％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
sequencelisting
<110>上海凌凯医药科技有限公司
<120>一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体
<160>7
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>563
<212>prt
<213>酿酒酵母
<400>1
metsergluilethrleuglylystyrleuphegluargleulysgln
151015
valasnvalasnthrvalpheglyleuproglyasppheasnleuser
202530
leuleuasplysiletyrgluvalgluglymetargtrpalaglyasn
354045
alaasngluleuasnalaargtyralaalaaspglytyralaargile
505560
lysglymetsercysileilethrthrpheglyvalglygluleuser
65707580
alaleuasnglyilealaglysertyralagluhisvalglyvalleu
859095
hisvalvalglyvalproserileserserglnalalysglnleuleu
100105110
leuhishisthrleuglyasnglyaspphethrvalphehisargmet
115120125
seralaasnilesergluthrthralametilethraspilecysthr
130135140
alaproalagluileaspargcysileargthrthrtyrvalthrgln
145150155160
argprovaltyrleuglyleuproalaasnleuvalaspleuasnval
165170175
proalalysleuleuglnthrproileaspmetserleulysproasn
180185190
aspalagluserglulysgluvalileaspthrileleuvalleuala
195200205
lysaspalalysasnprovalileleualaaspalacyscysserarg
210215220
hisaspvallysalagluthrlyslysleuileaspleuthrglnphe
225230235240
proalaphevalthrprometglylysglyserilesergluglnhis
245250255
proargtyrglyglyvaltyrvalglythrleuserlysprogluval
260265270
lysglualavalgluseralaaspleuileleuservalglyalaleu
275280285
leuserasppheasnthrglyserphesertyrsertyrlysthrlys
290295300
asnilevalgluphehisserasphismetlysileargasnalathr
305310315320
pheproglyvalglnmetlysphevalleuglnlysleuleuthrasn
325330335
ilealaaspalaalalysglytyrlysprovalalavalproalaarg
340345350
thrproalaasnalaalavalproalaserthrproleulysglnglu
355360365
trpmettrpasnglnleuglyasnpheleuglngluglyaspvalval
370375380
ilealagluthrglythrseralapheglyileasnglnthrthrphe
385390395400
proasnasnthrtyrglyileserglnvalleutrpglyserilegly
405410415
phethrthrglyalathrleuglyalaalaphealaalaglugluile
420425430
aspprolyslysargvalileleupheileglyaspglyserleugln
435440445
leuthrvalglngluileserthrmetileargtrpglyleulyspro
450455460
tyrleuphevalleuasnasnaspglytyrthrileglulysleuile
465470475480
hisglyprolysalaglntyrasngluileglnglytrpasphisleu
485490495
serleuleuprothrpheglyalalysasptyrgluthrhisargval
500505510
alathrthrglyglutrpasplysleuthrglnasplysserpheasn
515520525
aspasnserlysileargmetilegluvalmetleuprovalpheasp
530535540
alaproglnasnleuvalgluglnalalysleuthralaalathrasn
545550555560
alalysgln
<210>2
<211>563
<212>prt
<213>人工序列
<400>2
metsergluilethrleuglylystyrleuphegluargleulysgln
151015
valasnvalasnthrvalpheglyleuproglyasppheasnleuser
202530
leuleuasplysiletyrgluvalgluglymetargtrpalaglyasn
354045
alaasngluleuasnalaargtyralaalaaspglytyralaargile
505560
lysglymetsercysileilethrthrpheglyvalglygluleuser
65707580
alaleuasnglyilealaglysertyralagluhisvalglyvalleu
859095
hisvalvalglyvalproserileserserglnalalysglnleuleu
100105110
leuhishisthrleuglyasnglyaspphethrvalphehisargmet
115120125
seralaasnilesergluthrthralametilethraspilecysthr
130135140
alaproalagluileaspargcysileargthrthrtyrvalthrgln
145150155160
argprovaltyrleuglyleuproalaasnleuvalaspleuasntyr
165170175
proalalysleuleuglnthrproileaspmetserleulysproasn
180185190
aspalagluserglulysgluvalileaspthrileleuvalleuala
195200205
lysaspalalysasnprovalileleualaaspalacyscysserarg
210215220
hisaspvallysalagluthrlyslysleuileaspleuthrglnphe
225230235240
proalaphevalthrprometglylysglyserilesergluglnhis
245250255
proargtyrglyglyvaltyrvalglythrleuserlysprogluval
260265270
lysglualavalgluseralaaspleuileleuservalglyalaleu
275280285
leuserasppheasnthrglyserphesertyrsertyrlysthrlys
290295300
asnilevalgluphehisserasphismetlysileargasnalathr
305310315320
pheproglyvalglnmetlysphevalleuglnlysleuleuthrasn
325330335
ilealaaspalaalalysglytyrlysprovalalavalproalaarg
340345350
thrproalaasnalaalavalproalaserthrproleulysglnglu
355360365
trpmettrpasnglnleuglyasnpheleuglngluglyaspvalval
370375380
ilealagluthrglythrseralapheglyileasnglnthrthrphe
385390395400
proasnasnthrtyrglyileserglnvalleutrpglyserilegly
405410415
phethrthrglyalathrleuglyalaalaphealaalaglugluile
420425430
aspprolyslysargvalileleupheileglyaspglyserleugln
435440445
leuthrvalglngluileserthrmetileargtrpglyleulyspro
450455460
tyrleuphevalleuasnasnaspglytyrthrileglulysleuile
465470475480
hisglyprolysalaglntyrasngluileglnglytrpasphisleu
485490495
serleuleuprothrpheglyalalysasptyrgluthrhisargval
500505510
alathrthrglyglutrpasplysleuthrglnasplysserpheasn
515520525
aspasnserlysileargmetilegluvalmetleuprovalpheasp
530535540
alaproglnasnleuvalgluglnalalysleuthralaalathrasn
545550555560
alalysgln
<210>3
<211>1692
<212>dna
<213>酿酒酵母
<400>3
atgtctgaaattactttgggtaaatatttgttcgaaagattaaagcaagtcaacgttaac60
accgttttcggtttgccaggtgacttcaacttgtccttgttggacaagatctacgaagtt120
gaaggtatgagatgggctggtaacgccaacgaattgaacgctcgttacgccgctgatggt180
tacgctcgtatcaagggtatgtcttgtatcatcaccaccttcggtgtcggtgaattgtct240
gctttgaacggtattgccggttcttacgctgaacacgtcggtgttttgcacgttgttggt300
gtcccatccatctcttctcaagctaagcaattgttgttgcaccacaccttgggtaacggt360
gacttcactgttttccacagaatgtctgccaacatttctgaaaccactgctatgatcact420
gacatctgtaccgccccagctgaaattgacagatgtatcagaaccacttacgtcacccaa480
agaccagtctacttaggtttgccagctaacttggtcgacttgaacgtcccagctaagttg540
ttgcaaactccaattgacatgtctttgaagccaaacgatgctgaatccgaaaaggaagtc600
attgacaccatcttggtcttggctaaggatgctaagaacccagttatcttggctgatgct660
tgttgttccagacacgacgtcaaggctgaaactaagaagttgattgacttgactcaattc720
ccagctttcgtcaccccaatgggtaagggttccattagcgaacaacacccaagatacggt780
ggtgtttacgtcggtaccttgtccaagccagaagttaaggaagccgttgaatctgctgac840
ttgattttgtctgtcggtgctttgttgtctgatttcaacaccggttctttctcttactct900
tacaagaccaagaacattgtcgaattccactccgaccacatgaagatcagaaacgccact960
ttcccaggtgtccaaatgaaattcgttttgcaaaagttgttgaccaatattgctgacgcc1020
gctaagggttacaagccagttgctgtcccagctagaactccagctaacgctgctgtccca1080
gcttctaccccattgaagcaagaatggatgtggaaccaattgggtaacttcttgcaagaa1140
ggtgatgttgtcattgctgaaaccggtacctccgctttcggtatcaaccaaaccactttc1200
ccaaacaacacctacggtatctctcaagtcttatggggttccattggtttcaccactggt1260
gctaccttgggtgctgctttcgctgctgaagaaattgatccaaagaagagagttatctta1320
ttcattggtgacggttctttgcaattgactgttcaagaaatctccaccatgatcagatgg1380
ggcttgaagccatacttgttcgtcttgaacaacgatggttacaccattgaaaagttgatt1440
cacggtccaaaggctcaatacaacgaaattcaaggttgggaccacctatccttgttgcca1500
actttcggtgctaaggactacgaaacccacagagtcgctaccaccggtgaatgggacaag1560
ttgacccaagacaagtctttcaacgacaactctaagatcagaatgattgaggttatgttg1620
ccagtcttcgatgctccacaaaacttggttgaacaagctaagttgactgctgctaccaac1680
gctaagcaataa1692
<210>4
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
catgccatggattcaattactttgggtaaatatttgttcg40
<210>5
<211>34
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
ccgctcgagttgcttagcgttggtagcagcagtc34
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
aactagccagctaacttg18
<210>7
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
caagtcgaccaagttagc18