用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

肾综合征出血热(hfrs)是由汉坦病毒(hv)引起的、由啮齿类动物(主要为鼠类)传播的严重危害人民群众身体健康的重大传染病，我省是该病的重要疫区。hfrs临床表现以发热，出血和肾脏损害为主，起病急、病情重、死亡率高。hfrs的发病率和死亡率高居不下，已连续多年位于我国传染病前十位。因此，hfrs的早期诊断、早期治疗是至关重要的。

引起hfrs的hv有四种：汉滩病毒(htnv)、汉城病毒(seov)、普马拉病毒(puuv)和多布拉伐-贝尔格莱德病毒(dobv)。多年以来，危害我国的主要为htnv和seov，我国学者针对这两个亚型病毒的诊断和治疗已经进行了深入的研究。而puuv以往只流行于欧洲和俄罗斯远东地区，我国境内没有puuv的流行。2003年在吉林省抚松地区野鼠体内首次发现puuv，表明puuv已经传入我国，但目前尚未发现人感染puuv。然而，近年来有一个现象值得我们注意，临床研究表明：吉林省内多个地区(长春、吉林、通化等地区)新发的hfrs病人临床症状呈现不典型变化趋势，具体表现为病情分期(发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期、恢复期)不清(部分病人从发热期直接过度到少尿期甚至多尿期)、临床症状(发热、出血、肾损害)不典型(缺乏典型的三红、三痛症状)，危害严重，病人预后不良，十分类似puuv感染的临床表现，让我们无法忽视puuv的存在。我国人群对puuv普遍易感，但目前尚无特异的检测手段，也没有有效的疫苗预防，一旦puuv在人群中传播，会造成严重后果。因此，有必要开发特异性的puuv检测方法，加强puuv的检测力度，为hfrs的预防和治疗提供依据和保障。

目前，hv的实验室检测主要为血清学和核酸检测方法。血清学方法灵敏度低、特异性差、易漏检，不能进行早期诊断而贻误治疗。核酸检测方法主要为实时荧光定量pcr法，需要特殊仪器，成本高、耗时长、不易观察结果。环介导等温技术(rt-lamp)是一种新型核酸等温扩增技术，能在恒温条件下快速、灵敏、高效、特异地扩增目的基因，该方法具有灵敏性高、特异性强、反应耗时短、结果判读方便、设备要求简单等优点。yamazaki等采用rt-lamp方法对300份口蹄疫病毒样品检测结果显示，该方法的灵敏度和特异性分别为98.0％和98.1％，且未出现错检。用rt-lamp方法检测病毒，操作简便，可直接取疑似病变组织进行基因扩增，免去了常规pcr检测繁琐的核酸提取步骤。其最低检出量比常规pcr方法更低，其灵敏度高于pcr近一个量级，更适用于病毒感染前期的诊断，在临床早期诊断中呈现越来越重要的作用。

技术实现要素：

本发明设计开发了用于检测汉坦病毒的检测引物，本发明的目的是提供结果准确、特异性强、灵敏度高以及检测快速简便的检测引物。

本发明设计开发了用于检测汉坦病毒的检测试剂盒，本发明的目的是提供用于检测汉坦病毒的检测试剂盒。

本发明设计开发了用于检测汉坦病毒的检测方法，本发明的目的是提供检测汉坦病毒的检测方法。

本发明提供的技术方案为：

用于检测汉坦病毒的检测引物，所述检测引物包括汉滩病毒的检测引物、汉城病毒的检测引物和普马拉病毒的检测引物；

所述汉滩病毒的检测引物由序列表中的seqidno.1至序列表中的seqidno.4所示的碱基序列的核苷酸组成；其中，seqidno.1为上游外引物，seqidno.2为下游外引物，seqidno.3上游内引物，seqidno.4下游外引物；

所述汉城病毒的检测引物由序列表中的seqidno.5至序列表中的seqidno.8所示的碱基序列的核苷酸组成；其中，seqidno.5为上游外引物，seqidno.6为下游外引物，seqidno.7上游内引物，seqidno.8下游外引物；

所述普马拉病毒的检测引物由序列表中的seqidno.9至序列表中的seqidno.12所示的碱基序列的核苷酸组成；其中，seqidno.9为上游外引物，seqidno.10为下游外引物，seqidno.11上游内引物，seqidno.12下游外引物。

用于检测汉坦病毒的检测试剂盒，使用所述的用于检测汉坦病毒的检测引物。

优选的是，所述试剂盒还包括dna聚合酶、模板dna、ddh2o、指示剂。

优选的是，所述指示剂为羟基萘酚蓝。

用于检测汉坦病毒的检测方法，使用所述的用于检测汉坦病毒的检测试剂盒通过lamp反应检测。

优选的是，包括如下步骤：

步骤一、提取待测样品的质粒；

步骤二、配置lamp反应体系；其中，所述反应体系包括汉滩病毒的检测引物、汉城病毒的检测引物和普马拉病毒的检测引物；

步骤三、进行扩增反应，对待测样品进行检测；其中，自然光下反应体系颜色由湖蓝色变为天蓝色，判断检测结果为阳性。

优选的是，所述lamp反应体系包括：引物混合液、反应缓冲液、dna模板、dna聚合酶以及指示剂。

优选的是，所述lamp反应体系条件为61℃～65℃恒温温育1小时，反应结束后80℃灭活2分钟；以及

所述指示剂为羟基萘酚蓝，设置浓度为100～200μmol/l。

优选的是，所述待测样品为浓度为10^-7～10⁰梯度拷贝数。

本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：

1、结果准确，对汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的检测准确率可达100％；

2、特异性强，只能检测出汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒这三种亚型，而检测不出与汉坦病毒亲缘关系的新疆出血热病毒、q热病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒；

3、灵敏度高，能够达到的检出量为10⁰～10^-9；

4、快速简便，不用电泳检测，用肉眼即可观测到结果(即在自然光下观察颜色由湖蓝色变为天蓝色)。

附图说明

图1为本发明所述的3％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。(图中m为分子量标记，1为htnv，2为seov，3为puuv，4为xhfv，5为marburg，6为qfever，7为ebola，8为阴性对照)。

图2为本发明所述的htnv质粒的3％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。(图中m为分子量标记，1～10分别为10⁰～10^-9不同梯度拷贝数的检测结果)。

图3为本发明所述的seov质粒的3％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。(图中m为分子量标记，1～10分别为10⁰～10^-9不同梯度拷贝数的检测结果)。

图4为本发明所述的puuv质粒的3％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。(图中m为分子量标记，1～10分别为10⁰～10^-9不同梯度拷贝数的检测结果)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1检测引物设计与合成

1、材料

lampdna扩增试剂盒，质粒抽提试剂盒，dnamarker、汉滩病毒(htnv)、汉城病毒(seov)、普马拉病毒(puuv)、新疆出血热病毒(xhfv)、q热病毒(qfever)、马尔堡病毒(marburg)及埃博拉病毒(ebola)质粒均等购于上海(生工)生物科技有限公司。

2、引物设计与合成

本发明提供根据genbank公布的htnv(genbank：kt885049.1)、seov(genbank：ku204960.2)、puuv(genbank：kt247596.2)基因序列的保守区，应用primerexplorerv4软件设计引物，分别得到汉滩病毒(htnv)的检测引物组(包括序列表中的seqidno.1的上游外引物(f3)、seqidno.2的下游外引物(b3)、seqidno.3的上游内引物(fip)、seqidno.4的下游内引物(bip))、汉城病毒(seov)的检测引物组(包括序列表中的seqidno.5的上游外引物(f3)、seqidno.6的下游外引物(b3)、seqidno.7的上游内引物(fip)、seqidno.8的下游内引物(bip))和普马拉病毒(puuv)的检测引物组(包括序列表中的seqidno.9的上游外引物(f3)、seqidno.10的下游外引物(b3)、seqidno.11的上游内引物(fip)、seqidno.12的下游内引物(bip))，得到引物组的合成方法为固相亚磷酰胺三酯法合成，引物组如表1～3所示。

表1htnv检测引物序列

表2seov检测引物序列

表3puuv检测引物序列

实施例2用于检测汉坦病毒的lamp的检测试剂盒以及检测方法的建立1、模板制备：使用质粒提取试剂盒抽提htnv、seov、puuv、xhfv、qfever、marburg及ebola质粒，严格按试剂盒说明操作。

2、用于检测汉坦病毒的lamp的检测试剂盒：包括：汉滩病毒(htnv)的检测引物组(包括序列表中的seqidno.1的上游外引物(f3)、seqidno.2的下游外引物(b3)、seqidno.3的上游内引物(fip)、seqidno.4的下游内引物(bip))、汉城病毒(seov)的检测引物组(包括序列表中的seqidno.5的上游外引物(f3)、seqidno.6的下游外引物(b3)、seqidno.7的上游内引物(fip)、seqidno.8的下游内引物(bip))和普马拉病毒(puuv)的检测引物组(包括序列表中的seqidno.9的上游外引物(f3)、seqidno.10的下游外引物(b3)、seqidno.11的上游内引物(fip)、seqidno.12的下游内引物(bip))；dna聚合酶；模板dna；ddh2o；颜色指示剂羟基萘酚蓝(hnb)。

3、实验过程

(1)质粒提取

步骤一、质粒提取盒进行质粒提取，取1～5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm(～13400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；

步骤二、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；其中，溶液p1为50mm的蔗糖试剂，25mm、ph为8.0的tris-hcl缓冲试剂和10mm的edta组成的混合溶液；

步骤三、向离心管中加入250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；其中，溶液p2为0.2n的naoh和质量分数为1％的sds组成的混合溶液；

步骤四、向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀；使用离心机，设置转速为12000rpm(～13400×g)，离心10分钟；其中，溶液p3为3m的乙酸钾溶液，该溶液配置过程包括：使用300ml的5m的乙酸钾试剂，加入57.5ml的乙酸溶液，再加入ddh2o稀释到500ml，保存在4℃环境中待用；

步骤五、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀，设置转速为12000rpm(～13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中；

步骤六、可选步骤：向吸附柱cp3中加入500μl去蛋白液pd，设置转速为12000rpm(～13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3重新放回收集管中；

步骤七、向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)，设置转速为12000rpm(～13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中；

步骤八、重复操作步骤七；

步骤九、将吸附柱cp3放入收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；

步骤十、将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(2)lamp反应体系

步骤一、冰上溶解2×lampmastermix和引物，并充分混匀，然后按照如表4所示，建立反应体系：

表4反应体系

步骤二、将上述反应管充分混匀，然后置于65℃水浴锅中保温30-60min；

步骤三、80℃10min灭活dnapolymerase；

步骤四、反应产物可采用下述几种方法进行检测：

羟基萘酚蓝(hnb)法：在lamp反应体系中加入颜色指示剂hnb，肉眼观察反应前反应管颜色为湖蓝色，发生lamp反应管颜色变成天蓝色，说明扩增产物存在；否则表明无扩增；

琼脂糖电泳法：取3-5μl扩增产物，1％琼脂糖电泳检测，可见不同大小色带组成的lamp特征图谱。

4、lamp反应条件建立

(1)指示剂(hnb)浓度选择：在lamp反应体系中加入颜色指示剂hnb(反应前反应管颜色为湖蓝色，发生lamp反应后反应管颜色变成天蓝色)，设置100、125、150、175和200μmol/l等5个浓度，lamp反应完成后以颜色差别明显，利于观察为标准确定适宜hnb浓度。

(2)lamp反应体系建立与温度优化：lamp反应体系(25μl)：引物混合液5.0μl(含f3、b3各0.8μm，含bip、fip各0.2μm)，mastermix12.5μl，dna模板0.5μl(含dna0.16u/μl)，hnb1.0μl(反应浓度150μmol/l)，ddh2o5μl，dna聚合酶1.0μl；共配置5个相同的反应体系，分别在61、62、63、64、65℃恒温温育1h，80℃灭活2min；温度选择以扩增效率和反应时间长短为标准，并观察颜色变化结果与电泳和lamp浊度仪测定结果是否一致。

反应条件优化结果：经实验验证，温度64℃、时间60分钟，hnb浓度125μmol/l时lamp扩增效率最高，反应过程最短，颜色变化最明显，由湖蓝色变为天蓝色。

实施例3检测汉坦病毒试剂盒的特异性和灵敏性试验

1、特异性验证

分别以提取的htnv、seov、puuv、xhfv、qfever、marburg及ebola质粒为模板，分别以htnv、seov及puuv引物f3、b3、fip、bip进行环介导等温扩增，验证方法的特异性，并观察颜色变化是否与凝胶电泳仪测定结果一致。

特异性验证结果：如图1所示，分别以htnv、seov、puuv、xhfv、qfever、marburg及ebola质粒为模板，分别以htnv、seov、puuv引物进行lamp，图2显示不同实验组中htnv、seov和puuv反应管分别由湖蓝变为天蓝色，xhfv、qfever、marburg及ebola及阴性对照均未发生颜色变化，表明特异性好，且凝胶电泳检测结果(如图1所示)与hnb指示剂结果一致。

2、灵敏性验证

将htnv、seov、puuv质粒分别稀释成1mg/ml，并倍比稀释成10⁰～10^-9，分别以htnv、seov及puuv引物f3、b3、fip、bip进行环介导等温扩增，评价方法的灵敏性。

灵敏度验证结果：将htnv、seov、puuv质粒分别稀释成1mg/ml，并倍比稀释成10⁰～10^-9等10个梯度拷贝数，lamp反应结果三种病毒10^-9～10⁰拷贝反应管均出现颜色变化，表明其灵敏度可达10^-9，图2～4显示凝胶电泳检测结果与hnb指示剂结果一致。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

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