本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种壳聚糖衍生物制备方法及其在食品保鲜中的应用。
背景技术：
壳聚糖(chitosan，cts)是甲壳素在浓碱条件下或在脱乙酞酶存在的情况下进行脱乙酰化处理而得到的一种衍生物，它是一种不溶于水、能溶于酸的天然多糖，研究中通常用有机酸(如乙酸)来溶解。壳聚糖安全无毒、生物可降解，同时作为一种天然可再生资源，具有很高的疏水性、机械特性和抑菌性能，在食品保健与包装、农业、生物医药和污水处理等方面有广泛的应用。
在壳聚糖的基本结构单元上存在多个活性部位，在c-3和c-6位上均存在活性羟基基团，而c-2位上则存在活性氨基基团(-nh2)，将壳聚糖分散到l0wt％以下的酸溶液中时，c-2位置上的-nh2与h+质子结合，可以形成带正电(nh3+)的阳离子介质电解质，因此，壳聚糖在酸溶液中具有弱正电性，使生成的壳聚糖氨基盐与酸溶液形成透明的粘性胶体溶液。壳聚糖对某些细菌、真菌和酵母具有一定的抑菌活性。壳聚糖可抑制荧光假单胞菌、蜡状芽胞杆菌、念珠菌、乳酸菌、灰霉菌和李斯特菌等多种微生物的生长。
壳聚糖虽具有广谱抑菌性，但其抑菌活性仍低于大多数化学合成的抑菌剂，并且中、高分子量的壳聚糖溶解性较差，分子内及分子间形成大量的氢键。此外，壳聚糖分子上因缺少氢原子供体而抗氧化性较差。通过接枝抗氧化强的小分子物质可以改善壳聚糖的抗氧化性和抑菌性。壳聚糖c-3位的仲经基、c-6位的伯经基和c-2位的氨基是活性官能团，尤其是c-2位的氨基活性最高，可以通过在c-2位的氨基接枝小分子物质进行改性。目前，对壳聚糖改性使用化学方法的较多，但用到的化学试剂(如酞氯、醛、环氧化物等)危害性极大，对环境造成严重污染，并且化学改性需要步骤复杂、副产物多、产率低。生物催化法具有独特的优势，其反应条件温和、反应效率高、副产物较少、对环境友好。
漆酶(laccase，ec1.10.3.2，lac)，是自然界普遍存在的一种含铜金属酶类，可催化各种酚类物质如儿茶素、单宁、黄酮等氧化为醌。大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门(basidiomycota)、子囊菌门(ascomycota)及半知菌类(imperfectfungi)等真菌，其中最主要的是担子菌门中的白腐真菌。真菌漆酶最大的问题是其热稳定性差，ph稳定性差不适合于实际的生产加工应用。细菌来源漆酶具有良好热稳定性，在催化反应壳聚糖接枝酚酸物质的过程中与加热物理变性可以起到协同作用，促进共价接枝反应的进行。而目前关于热稳定性的重组细菌漆酶应用于制备壳聚糖衍生物还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种壳聚糖衍生物的制备方法，并应用于食品保鲜。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种壳聚糖衍生物的制备方法，壳聚糖衍生物是通过壳聚糖粉末在含有酚酸类化合物和重组细菌漆酶的反应液中，60-85℃温度条件下反应0.5-4h而得；所述的酚酸类物质选自阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、五倍子酸、没食子酸、儿茶素、单宁酸、茶多酚中的任意一种。
所述的反应液优选含有如下物质：
(a)1-2wt％的壳聚糖粉末；
(b)5-20mm的酚酸类化合物；
(c)1-3u/100ml的重组细菌漆酶；
(d)使用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中任意一种或两种酸调节反应缓冲液的ph至4-7，酸的浓度为50-100mmol/l。
所述的壳聚糖粉末包括分子量优选10-400kda,进一步优选10kda,50kda,150kda,200kda,300kda和400kda的壳聚糖。
所述的壳聚糖衍生物的制备方法，优选包括如下步骤：
(1)将酚酸类化合物溶解于纯水，酚酸类化合的浓度为5-20mm，优选10mm；
(2)用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中的任意一种或两种调节ph至4-7，优选6.5；
(3)加入壳聚糖粉末；
(4)加入重组细菌漆酶，质量百分浓度为酶活浓度为1-2u/100ml反应液，优选1u/100ml反应液。
(5)磁力搅拌器搅拌条件下，搅拌器转速50-150rpm，75-85℃反应0.5h-4h；
(6)反应结束后，自然沉降，或离心机离心获得接枝酚酸类化合物的壳聚糖衍生物。
步骤(5)磁力搅拌器搅拌条件优选搅拌转速为100rpm，80℃，反应1h。
步骤(6)所述的离心条件优选3000-5000rpm离心10-20min；进一步优选4000rpm，15min。
所述的壳聚糖衍生物的制备方法，优选还包括(7)将步骤(6)获得的沉淀物经过三次乙醇清洗后，自然晾干得接枝酚酸类化合物得壳聚糖衍生物。
本发明中所述的重组漆酶优选通过如下方法制备：
(1)提取保藏号为cgmccno.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103的基因组dna，设计上、下游引物，以fmb-103的基因组dna为模板，pcr扩增漆酶基因；；
(2)将上一步纯化的pcr产物经saci、xhoi双酶切后插入载体pet-23a的saci/xhoi酶切位点之间，获得含有fmb-l103基因的表达质粒pet-23a-fmb-l103；
(3)将含有fmb-l103表达质粒pet-23a-fmb-l103转化大肠杆菌表达宿主菌株bl21(de3)plyss，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50mllb液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100mllb液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至od600约为0.6时加iptg(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；
(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照ni-ntahistagkit说明书进行纯化。
按照所述的制备方法制备得到的壳聚糖衍生物。
本发明所述的壳聚糖衍生物在在食品抗菌、抗氧化和/或保鲜中的应用。
所述的食品优选自果蔬、肉制品、奶制品或油脂类制品。
有益效果：
本发明针对壳聚糖抗氧化性和抗菌性能力不足的问题，以重组细菌漆酶作为催化剂，催化各种酚酸类化合物共价接枝到壳聚糖分子，制备抗氧化和抗菌性能改良的壳聚糖衍生物。本发明中的方法与化学法比，具有环境友好的优势，属于一种绿色生产方式。并且使用的重组细菌漆酶具有良好的热稳定性，催化反应液能多次重复利用，弥补了真菌漆酶在实际生产加工中极易失活的问题。催化制备的壳聚糖衍生物在抗氧化和抗菌性能方面显著提高，对果蔬、肉制品、奶制品、油脂类等食品具有良好的抗菌抗氧化保鲜效果。
生物材料保藏信息
死亡谷芽孢杆菌fmb-103，分类命名为bacillusvallismortis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为cgmccno.6198。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)fmb-103漆酶基因的克隆
离心收集死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)fmb-103菌体(cgmccno.6198)，用上海生工基因组dna提取试剂盒提取死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)fmb-103的基因组dna。
根据genebank数据库中已登录的芽孢杆菌漆酶基因(no.gu972592.1)设计两个引物：
上游引物f-1：5’-atgacacttgaaaaatttgtggatgc-3’(seqidno.3)；
下游引物r-1：5’-ttatttatggggatcagttatatc-3’(seqidno.4)；
在50μl体系中，引物终浓度各为1μm，dntps终浓度为0.2mm,fmb-103菌株基因组dna10ng，2upfudna聚合酶。扩增程序为94℃3min；30×(94℃40s，53℃50s，72℃90s)；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的pcr产物与takarapmd19-simple-tvector连接，转化e.colidh5α，涂于含有iptg、x-gal、氨苄青霉素的lb平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序，用计算机软件dnaman分析测序结果，得到一个序列如seqidno.1所示的长度为1542bp的orf，即fmb-103漆酶基因(fmb-l103)，编码一个由514个氨基酸组成的蛋白质，序列如seqidno.2所示。
实施例2：死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)fmb-103漆酶基因原核表达载体的构建
根据获得的漆酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上saci识别序列，下游引物加上xhoi识别序列(下划线部分为限制酶识别序列):
上游引物f-2：5′-cgcgagctcatgacacttgaaaaatttgtggatgc-3′(seqidno.5),
下游引物r-2:5′-ccgctcgagttatttatggggatcagttatatc-3′(seqidno.6),
按照下列pcr体系加入各成分，扩增漆酶基因:
pcr程序为：94℃3min；30×(94℃40s；53℃50s；72℃90s)；72℃10min。
用上海生工pcr产物纯化试剂盒纯化pcr产物，加saci、xhoi双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddh2o重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pet-23a连接，转化大肠杆菌dh5α。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入lb液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行pcr验证，确定连接成功后送到上海生工测序。
实施例3：死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)fmb-103漆酶基因在大肠杆菌中的表达
将含有fmb-l103表达质粒pet-23a-fmb-l103转化大肠杆菌表达宿主菌株bl21(de3)plyss，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50mllb液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜，按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100mllb液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至od600约为0.6时加iptg(终浓度100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，获得重组死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)漆酶(fmb-rl103)的粗酶液。
漆酶活性测定采用2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(abts)法稍作改动：反应体系总体积3ml，包括2.45ml0.2mol/lph5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液、0.5ml6mmol/labts及50μl用ph5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶粗提液，45℃测定反应的前3min内反应液在420nm处吸光值od的增加量，以灭活酶液做空白对照。将每分钟内生成1μmol反应物所需的酶量定义为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式：漆酶活力(u)＝v总×δod/(v酶×ε×δt×10-6)×总酶酶液稀释倍数；其中，ε＝3.6×104mol/cm；δt：3min；δod：3min内吸光度od的变化值；v总：酶反应中，反应液的总体积；v酶：酶反应中，酶液的体积。实验重复3次，取平均值。
采用上述方法测得pet-23a-fmb-l103转化bl21(de3)plyss后的工程菌，重组漆酶的产量为12000u/ml发酵液。
实施例4：重组死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)fmb-103漆酶(fmb-rl103)的分离纯化
采用nta(镍柱，ge公司产品)亲和层析法对实例3中获得的fmb-rl103粗酶液进行分离纯化。
样品中加5mm咪唑(终浓度)，增强吸附柱。
上样前，用20mm咪唑平衡层析柱。样品过三次柱材料，达到fmb-rl103与亲和柱材料充分结合的目的。
上样结束后，用100mm咪唑洗脱(分别用10个柱床体积)，收集洗脱液测酶活。上述纯化制备的重组漆酶fmb-rl103酶活为3.6u/mg蛋白。
实施例5：重组细菌漆酶催化壳聚糖衍生物合成的流程
(1)重组细菌漆酶催化制备分子量为150kda和400kda的壳聚糖接枝阿魏酸衍生物
阿魏酸溶解于100ml的ph为6.5的50mmol/l磷酸盐缓冲液，阿魏酸的浓度为10mmol/l。后将1g分子量壳聚糖粉(分子量为150kda或400kda的壳聚糖)分散于缓冲溶液，并加入2u重组细菌漆酶。磁力搅拌器100rpm搅拌条件下，80℃反应1h。反应完成后，离心机5000rpm离心15min获得沉淀物。将沉淀物用75％乙醇清洗3次，然后自然晾干得到的样品即为壳聚糖接枝阿魏酸的衍生物。
(2)重组细菌漆酶催化制备分子量为150kda和400kda的壳聚糖接枝没食子酸衍生物
没食子酸溶解于100ml的ph为6.5的50mmol/l磷酸盐缓冲液，阿魏酸的浓度为12mmol/l。后将1g分子量壳聚糖粉(分子量为150kda或400kda的壳聚糖)分散于缓冲溶液，并加入2u重组细菌漆酶。磁力搅拌器100rpm搅拌条件下，60℃反应1h。反应完成后，离心机5000rpm离心15min获得沉淀物。将沉淀物用75％乙醇清洗3次，然后自然晾干得到的样品即为壳聚糖接枝咖啡酸的衍生物。
(3)重组细菌漆酶催化制备分子量为150kda和400kda的壳聚糖接枝咖啡酸衍生物
咖啡酸溶解于100ml的ph为6.0的50mmol/l磷酸盐缓冲液，咖啡酸的浓度为8mmol/l。后将1g分子量壳聚糖粉(分子量为150kda或400kda的壳聚糖)分散于缓冲溶液，并加入2u重组细菌漆酶。磁力搅拌器100rpm搅拌条件下，80℃反应1h。反应完成后，离心机5000rpm离心15min获得沉淀物。将沉淀物用75％乙醇清洗3次，然后自然晾干得到的样品即为壳聚糖接枝咖啡酸的衍生物。
(4)重组细菌漆酶催化制备分子量为150kda和400kda的壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物
儿茶素溶解于100ml的ph为6.5的50mmol/l磷酸盐缓冲液，儿茶素的浓度为5mmol/l。后将1g分子量壳聚糖粉(分子量为150kda或400kda的壳聚糖)分散于缓冲溶液，并加入2u重组细菌漆酶。磁力搅拌器100rpm搅拌条件下，70℃反应1h。反应完成后，离心机5000rpm离心15min获得沉淀物。将沉淀物用75％乙醇清洗3次，然后自然晾干得到的样品即为壳聚糖接枝儿茶素的衍生物。
实施例6：壳聚糖衍生物抗氧化性能
测定dpph自由基清除能力：将壳聚糖和壳聚糖接枝衍生物样品分别溶于1％(v/v)乙酸溶液中，使浓度分别为2mg/ml。取试管加入1×10-4mol/l的dpph无水乙醇溶液2ml、壳聚糖溶液2ml，迅速摇匀后在33℃下避光静置反应30min，在517nm下测定样品溶液的吸光值，记为asampl。用1％乙酸溶液代替样品溶液做为对照，测得吸光度acontrol，自由基清除率计算公式如下：
注：用ec50表示样品的dpph自由基清除能力，ec50即自由基清除率为50％时的样品浓度，mg/ml。
如表1所示，与接枝反应前的壳聚糖比较，制备的壳聚糖接枝产物，表现出的抗氧化能力明显提高。
表1壳聚糖及壳聚糖接枝衍生物的抗氧化性能
mm-cts：分子量为150kda壳聚糖；mm-cts-fa：150kda壳聚糖接枝阿魏酸衍生物；mm-cts-ga：150kda壳聚糖接枝没食子酸衍生物；mm-cts-ca：150kda壳聚糖接枝咖啡酸衍生物；mm-cts-cat：150kda壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物；
hm-cts：分子量为400kda壳聚糖；hm-cts-fa：400kda壳聚糖接枝阿魏酸衍生物；hm-cts-ga：400kda壳聚糖接枝没食子酸衍生物；hm-cts-ca：400kda壳聚糖接枝咖啡酸衍生物；hm-cts-cat：400kda壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物。
实施例7：壳聚糖衍生物抗菌性能
采用牛津杯法测定壳聚糖和及壳聚糖接枝衍生物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽抱杆菌以及酵母菌的抑菌能力。将壳聚糖及壳聚糖接枝衍生物溶解于0.1mol/l的盐酸溶液中(浓度分别为1mg/ml)。每个平板内均匀放置4个消毒灭菌过的牛津杯，将加入0.1ml指示菌(菌液浓度为105～106cfu/ml)的培养基(细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；酵母菌：pda培养基)倒板，自然冷却30min，取出牛津杯，向孔中加入0.2ml已配制好的样品溶液，培养箱中培养24h(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌37℃；酵母菌28℃)，测定抑菌圈直径。
如表2所示，与接枝反应前的壳聚糖比较，制备的壳聚糖接枝产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的抑菌活性具有较明显的提高
表2壳聚糖及壳聚糖接枝衍生物的抑菌性能
mm-cts：分子量为150kda壳聚糖；mm-cts-fa：壳聚糖接枝阿魏酸衍生物；mm-cts-ga：壳聚糖接枝没食子酸衍生物；mm-cts-ca：壳聚糖接枝咖啡酸衍生物；mm-cts-cat：壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物；
hm-cts：分子量为400kda壳聚糖；hm-cts-fa：400kda壳聚糖接枝阿魏酸衍生物；hm-cts-ga：400kda壳聚糖接枝没食子酸衍生物；hm-cts-ca：400kda壳聚糖接枝咖啡酸衍生物；hm-cts-cat：400kda壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物；
实施例8：壳聚糖衍生物对食品的保鲜效果
以壳聚糖接枝衍生物对芒果的保鲜效果为例进行说明。
选择大小一致，颜色一致，形状均匀，无缺缺陷和疾病的芒果120个，分为每个处理4个重复。将10g壳聚糖及壳聚糖接枝衍生物分别溶解到600ml1％的乙酸溶液中，喷涂到芒果表面，放入恒温恒湿箱中(25℃，rh50％)迅速干燥成膜。对照组ck1为不涂膜处理，对照组ck2为1％的乙酸溶液喷涂处理，处理每4天采样一次，直到第16天。
由表3可以看出，经壳聚糖接枝衍生物涂膜处理后，芒果在硬度失重率，转黄指数和病害率方面，表现出较好保鲜效果。
表3贮藏期间壳聚糖涂膜处理对芒果的保鲜指标
mm-cts：分子量为150kda壳聚糖；mm-cts-fa：150kda壳聚糖接枝阿魏酸衍生物；mm-cts-ga：150kda壳聚糖接枝没食子酸衍生物；mm-cts-ca：150kda壳聚糖接枝咖啡酸衍生物；mm-cts-cat：150kda壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物；
hm-cts：分子量为400kda壳聚糖；hm-cts-fa：400kda壳聚糖接枝阿魏酸衍生物；hm-cts-ga：400kda壳聚糖接枝没食子酸衍生物；hm-cts-ca：400kda壳聚糖接枝咖啡酸衍生物；hm-cts-cat：400kda壳聚糖接枝儿茶素酸衍生物。
序列表
<110>泰兴市东圣生物科技有限公司
南京农业大学
<120>一种壳聚糖衍生物制备方法及其在食品保鲜中的应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1542
<212>dna
<213>死亡谷芽孢杆菌(bacillusvallismortisfmb-103)
<400>1
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