一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用与流程

本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用anp或iganp基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和在制备抑制舌癌细胞活性的药物中的应用。

背景技术：

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，98％以上为鳞状细胞癌，其生物学特性主要表现为局部浸润生长及颈部淋巴结转移。舌鳞癌患者颈部淋巴结转移率较高，易发生早期颈淋巴结转移，发生颈淋巴结转移者的预后较未发生颈淋巴结转移者明显变差，颈淋巴结转移是导致舌鳞癌患者死亡的重要因素之一。因此，如何抑制癌细胞转移，提高治疗预后性显得尤为重要。

在过去几十年里人们癌症的研究和治疗已经取得了重大进展。然而，传统的癌症治疗效果不理想，大多数化疗药物对癌细胞有杀伤性但也对健康快速分裂的细胞有杀伤性，并且也会抑制免疫系统，同时也存在着癌症耐药性以及瘤区药物浓度不足等问题。这大大降低了他们的治疗效果，其原因与药物对癌症细胞特异性不足有关。由于需要不断寻找新的治疗药物，尤其是那些能够逃避耐药性、抑制转移和无其他重要的副作用的药物，抗癌肽已成为新的研究的目标之一。抗癌肽是一类小分子多肽类新型抗癌药物，通过破坏肿瘤细胞膜结构或抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成达到对癌细胞杀伤作用，而对正常细胞的毒性较低，是目前抗肿瘤新药研究的一大热点。

心房利钠肽(anp)是一种由28个氨基酸残基组成的多功能活性肽，亦称心房利钠因子、心房利尿肽、心钠素或心房肽。最早从大鼠以及人的心房组织中分离出一种具有利钠利尿的活性多肽物质——心房利尿肽，在临床上具有增加血管通透性、降压、利钠、利尿、舒张血管平滑肌及抑制细胞增殖等作用，在维持血压，水、钠平衡及在心血管疾病的病理生理过程中发挥的重要作用已得也到了广泛的认可。在最近的研究发现，它可以直接杀死肿瘤细胞或强力抑制癌细胞dna的合成，从而抑制癌细胞的生长，而对正常的人体细胞不会产生毒性反应。

现有的给药途径包括口服给药、呼吸道给药、经皮给药。胃肠道对蛋白质多肽类药物的低吸收及其中的酶对药物的降解是口服多肽类药物面临的两大障碍。因此，寻找合适的吸收位点，避免胃肠道的酶降解作用以及肝脏的首过效应是解决问题的关键。多肽药物在呼吸道给药的同时也面临着鼻粘膜中氨肽酶对多肽降解的威胁，鼻腔纤毛的清除作用也会影响多肽药物的吸收。经皮给药可以避免蛋白酶的直接降解和组织器官的清除作用，但是此方法必须克服皮肤角质层的屏障，为促进多肽药物进入皮肤，目前应用较多的是离子导入技术，但是该系统大多还处于实验室阶段，仍然存在一些问题，比如：通过皮肤的电流，因皮肤的生理条件而受强度和持续时间的限制；促渗机制的确定；透皮药物的选择；导入装置的更加实用、方便、经济等都需进一步研究。

本发明根据抑制肿瘤细胞转移提高癌症治疗预后性的策略提供了一种新的、有临床应用前景的抑制肿瘤细胞转移的靶向药物。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，以anp或分泌型anp(iganp)为目的基因构建重组腺病毒载体，用重组腺病毒载体作为舌癌基因治疗的系统，利用表达anp或分泌型anp的基因治疗方法可以起到抑制舌癌细胞活性和迁移的作用。

为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种利用anp或分泌型anp基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

1)proanp基因片段的获得：

a、细胞总rna的提取；

b、cdna的获得；

c、proanp基因扩增：proanp基因扩增体系所用的引物如下：

sene：cgggtaccccatgagctccttctccaccacc；

antisene：gctctagagctcagtaccggaagctgttacagc；

重叠pcr引物1：cttccaaatggtccagcaaattcttgaaatccatcaggtctgcg；

重叠pcr引物2：cgcagacctgatggatttcaagaatttgctggaccatttggaag；

2)anp和iganp基因片段的获得：

a、利用pcr反应从proanp片段中获取anp基因，所用引物如下：

anpsens序列：cggaattccggccaccatgagcctgcggagatccagc；

anpanti序列：gctctagagctcagtaccggaagctgttacagc；

b、重叠pcr反应获得iganp基因：

首先，利用pcr反应合成可用于重叠pcr的igκ信号肽基因，所用引物如下：

igκsens序列：

cggaattccggccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctggg；

igκanti序列：

gcagctggatctccgcaggctgtcaccagtggaacctggaacccagagcagcagtaccc。

以及，利用pcr反应从proanp片段中获取可用于重叠pcr的secanp基因，所用引物如下：

secanpsens序列：agcctgcggagatccagc；

anpanti序列：gctctagagctcagtaccggaagctgttacagc；

最后，以上述igκ信号肽基因和anp基因为模板，获得iganp基因片段，所用引物为secanpsens和igκanti；

3)padtrack-iganp或padtrack-anp穿梭载体的构建：iganp或anp与padtrack-cmv载体连接；

4)pad-iganp或pad-anp腺病毒骨架载体的构建：padtrack-iganp或padtrack-anp质粒pmei单酶切，取回收产物与pad-easy质粒一起转化bj5183感受态中，提取质粒即pad-iganp或pad-anp；

5)制备重组腺病毒ad-iganp或ad-anp：将提取的pad-iganp或pad-anp质粒，使用paci单酶切线性化后，使用lipofectamine2000转染293-a细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因的表达，7天后可看到大量细胞漂浮,荧光开始减弱，此时先吸出一部分上清液转移到无菌的15ml的离心管中，剩余的培养基反复吹打皿底未漂浮的细胞，将其同培养基一起转移到离心管中；1000转，5min，离心收集上清液，即为包装后获得的重组腺病毒ad-iganp或ad-anp。

本发明第二方面，提供由上述方法制备的重组腺病毒，其表达anp或分泌型anp，所述anp的序列如seqidno：1所示，分泌型anp的序列如seqidno：2所示。

slrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry(seqidno：1)；

metdtlllwvlllwvpgstgdslrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry(seqidno：2)。

由于密码子的简并性，本发明所述anp基因的序列还可以包括任何能编码seqidno：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述分泌型anp基因的序列还可以包括任何能编码seqidno：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

优选地，其携带的anp基因的核苷酸序列为:

agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtactga(seqidno：3)；

优选地，其携带的分泌型anp基因的核苷酸序列为:

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacagcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtactga(seqidno：4)。

优选地，构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为padtrack-cmv载体；

优选地，构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为padeasy-1；

优选地，构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为哺乳动物细胞，优选人胚肾293-a细胞。

在第三方面，本发明提供一种重组腺病毒质粒，其通过携带anp或分泌型anp基因的重组穿梭质粒与病毒骨架质粒同源重组得到；

优选地，所述重组穿梭质粒为track载体携带anp或分泌型anp基因构成的，本发明中表示为padtrack-iganp或padtrack-anp；

优选地，所述病毒骨架质粒为padeasy-1；

优选地，所述同源重组发生在大肠杆菌内，优选大肠杆菌bj5183。

在第四方面，提供上述利用anp或分泌型anp基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在制备抑制舌癌细胞活性的药物中的应用。

本发明用重组腺病毒载体在舌癌细胞scc9内表达anp多肽，同时在anp序列前添加一个免疫球蛋白的信号肽序列，构建分泌型anp多肽实验组(下文标记均为iganp)。通过rt-pcr，证实了anp可以在舌癌细胞scc9中表达，通过mtt细胞相对活性检测和细胞划痕实验，证实了anp在体外实验中具有抑制舌癌细胞scc9活性和迁移的作用，并且iganp的作用效果更为明显。从而抑制舌癌细胞生长。

附图说明

图1pcr获取proanp基因片段电泳图；

图2iganp(anp)双酶切电泳图；

图3pcr检测ad-anp基因组中整合电泳图；

图4pcr检测ad-iganp基因组中整合电泳图；

图5rt-pct检测anp和iganp在scc9中的表达；

图6anp和iganp的划痕实验；

图7anp和iganp的划痕实验迁移分析图；

图8mtt检测不同处理方式对人舌鳞癌细胞scc9相对活性的影响；

图9流式细胞仪检测细胞周期图；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】获取目的基因anp和iganp

1、proanp基因片段的获得

1.1引物设计

根据人anp基因的genebank号nm_006172.3获得基因序列，其中cds区有456bp，序列如下所示：

atgagctccttctccaccaccaccgtgagcttcctccttttactggcattccagctcctaggtcagaccagagctaatcccatgtacaatgccgtgtccaacgcagacctgatggatttcaagaatttgctggaccatttggaagaaaagatgcctttagaagatgaggtcgtgcccccacaagtgctcagtgagccgaatgaagaagcgggggctgctctcagccccctccctgaggtgcctccctggaccggggaagtcagcccagcccagagagatggaggtgccctcgggcggggcccctgggactcctctgatcgatctgccctcctaaaaagcaagctgagggcgctgctcactgcccctcggagcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtactga。

根据如上基因序列利用primerpremier5设计如下引物(表1)。anp扩增引物中，上游引物添加kpni酶切位点，下游引物xbai酶切位点。anp重叠pcr引物，片段一上游引物和片段二下游引物与anp扩增引物一致。

扩增引物sene：cgggtaccccatgagctccttctccaccacc；酶切位点：kpni。

antisene：gctctagagctcagtaccggaagctgttacagc；酶切位点：xbai

检测引物sene：acgcagacctgatggatttc。

antisene：gcttcttcattcggctcact。

重叠pcr引物1：cttccaaatggtccagcaaattcttgaaatccatcaggtctgcg。

重叠pcr引物2：cgcagacctgatggatttcaagaatttgctggaccatttggaag。

1.2rt-pcr

细胞总rna的提取

①收集细胞，加入1mltrizol试剂混合；

②加入200μl三氯甲烷，涡旋，使其混匀充分，至溶液乳化成白色，置于冰上10min；

③4℃12000rpm/min离心10min，取出离心管，溶液呈三层，上清液含rna，吸取上清液于无核酸酶的2ml的ep管中，注意切勿吸出中间白色层。向ep管中加入等体积异丙醇。缓慢上下颠倒ep管数次，使其充分混匀，置于-20℃，10min；

④4℃12000rpm/min离心10min，ep管底部都会出现少量白色沉淀，小心吸去上清。加入1ml无水乙醇，用移液枪将ep管底部的沉淀吹打起来；

⑤4℃7500rpm/min离心5min，弃上清，置于超净工作台，使其风干。最终白色沉淀呈半透明状。加入20μl无rnase的水溶解；

1.3cdna的获得

293-t及scc-9细胞rna反转录体系：amv(反转录酶)1μl，dntp3μl，rna酶抑制剂0.5μl，5×buffer4μl，oligo(dt)1μl，rnatemplate10.5μl。

反转录程序：30℃10min，42℃50min,95℃50min，10℃5min。在pcr仪上进行反转录反应。

1.4proanp基因片段的获得

293-t及scc-9细胞cdnapcr体系：ddh2o12.3μl，pcrbuffer10×2μl，dntpmixture2.5μl，rtaq酶0.2μl，primerf1μl，primerr1μl，template1μl。

pcr程序设定如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃15min。

pcr反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳(如图1)。

2、获取anp和iganp基因片段的引物设计

根据人anp的氨基酸序列slrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry中，得到其所对应的碱基序列如下所示：

agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtactga

根据igκ信号肽的氨基酸序列metdtlllwvlllwvpgstgd，得到其所对应的碱基序列如下所示：

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac

根据如上基因序列利用primerpremier5设计如下引物。在anp扩增引物中，上游引物中有添加ecori酶切位点，kozak序列片段和atg，下游引物中加有xbai酶切位点。在与igκ信号肽连接所用的secanp扩增引物中，上游引物选取anp基因序列的前18个碱基序列，下游引物与anp扩增引物中的下游引物一样。在与secanp连接所用到的igκ信号肽的扩增引物中，上游引物中添加ecori酶切位点，kozak序列，下游引物选取igκ信号肽部分基因序列与anp的部分基因序列。

anpsens序列：cggaattccggccaccatgagcctgcggagatccagc；酶切位点：ecori。

anpanti序列：gctctagagctcagtaccggaagctgttacagc；酶切位点：xbai。

secanpsens序列：agcctgcggagatccagc。

igκsens序列：cggaattccggccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctggg；酶切位点：ecori。

igκanti序列：gcagctggatctccgcaggctgtcaccagtggaacctggaacccagagcagcagtaccc。

利用pcr反应从proanp片段中获取anp，反应体系：10×buffer2.5μl，anpsens1μl，anpanti1μl，taq酶0.2μl，dntp2μl，ddh2o18.1μl，模板0.2μl。重叠pcr反应合成igκ信号肽体系如下：10×buffer2.5μl，igκsens2μl，igκanti2μl，taq酶0.2μl，dntp2μl，ddh2o16.3μl。利用pcr反应从proanp片段中获取可用于重叠pcr的anp体系如下：10×buffer2.5μl，secanpsens1μl，anpanti1μl，taq酶0.2μl，dntp2μl，ddh2o18.1μl，模板0.2μl，重叠pcr反应合成含有信号肽的anp体系如下：5×buffer(pfu)5μl，igκanti5μl，secanp5μl，taq酶0.3μl，pfu酶0.2μl，dntp2μl，ddh2o7.5μl。所有的pcr反应程序一样，所有设定如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃5min。

【实施例2】携带anp或分泌型anp基因的重组腺病毒的制备

1重组腺病毒基因载体的构建

1.1pmd-20t-iganp或pmd-20t-anp载体的构建与鉴定

iganp或anp与pmd-20t载体连接体系：solutioni5μl，pmd-20t载体0.5μl，重叠iganp或anp回收产物2.6μl，ddh2o1.9μl。

连接体系置于16℃恒温仪过夜。kpni、xbai双酶切鉴定，反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳(如图2)。由生工生物工程(上海)股份有限公司武汉测序部进行测序鉴定。

1.2padtrack-iganp或padtrack-anp穿梭载体的构建与鉴定

iganp或anp与padtrack-cmv载体连接体系：t4连接酶buffer10×2μl，t4连接酶2μl，iganp或anp回收产物2μl，padtrack-cmv4μl，ddh2o10μl。

连接体系置于16℃恒温仪过夜。转化dh5α大肠杆菌，提取质粒后kpni、xbai双酶切鉴定。反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。

1.3pad-iganp或pad-anp腺病毒骨架载体的构建与鉴定

padtrack-iganp或padtrack-anp质粒pmei单酶切体系：ddh2o29.5μl，bbuffer10×5μl，padtrack-iganp或padtrack-anp15μl，pmei0.5μl。置于37℃恒温水浴锅单酶切反应鉴定，反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。参考tiangen的dna凝胶回收试剂盒进行胶回收(见附图2，1、2、3泳道为padtrack-iganp，4、5泳道为padtrack-anp)。取回收产物与pad-easy-1质粒一起转化bj5183感受态中，提取质粒即pad-iganp或pad-anp。

将提取的pad-iganp或pad-anp质粒，使用paci置于37℃恒温水浴锅进行单酶切，paci单酶切体系：ddh2o9.8μl，pacibuffer10×2μl，pad-iganp或pad-anp8μl，paci0.2μl。反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。置于37℃恒温水浴锅单酶切反应鉴定，反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。

1.4中量质粒的提取

参考tiangen公司高纯度中量质粒提取说明书，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5单酶切乙醇沉淀回收

将提取的pad-iganp质粒，使用paci置于37℃恒温水浴锅进行单酶切3h，paci单酶切体系：ddh2o9.8μl，pacibuffer10×2μl，plasmid8μl，paci0.2μl。酶切产物用乙醇沉淀回收步骤如下：

①取出酶切好的体系后，转移到1.5mlep管中，并在体系中加入ddh2o定容至200μl；

②加入1/10提及的乙酸钠(3mol/l，ph＝5.2)与体系中充分混合均匀；

③加入2倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀。放置于-20℃，30min；

④12000rpm，4℃离心10min，收集dna沉淀；

⑤打开管口，弃尽上清，加入1ml70％乙醇于ep管中，将沉淀弹起洗涤充分。12000rpm，4℃离心5min，弃上清，室温风干乙醇；

⑥加入10μlddh2o溶解dna。

2.制备重组腺病毒ad-iganp或ad-anp

2.1重组腺病毒载体pad-iganp转染293-a细胞

293-a细胞在含有小牛血清10％的dmem的培养液置于37℃，5％的co2孵箱中培养。重组pad-iganp或pad-anp质粒经paci单酶切线性化后，使用lipofectamine2000转染293-a细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因的表达,7天后可看到大量细胞漂浮,荧光开始减弱。此时先吸出一部分上清液转移到无菌的15ml的离心管中，剩余的培养基反复吹打皿底未漂浮的细胞，将其同培养基一起转移到离心管中；1000转，5min，离心收集上清液，分装到1.5ml的ep管中，每管1ml，置于-20℃保存，这就是重组腺病毒ad-iganp或ad-anp。

2.2含有iganp的腺病毒的扩增

①293a细胞的培养和传代，将大约为90％汇合度的60mm皿的293a细胞接种在10cm的培养皿中，所用培养基为高糖dmem(10％fbs)，培养条件为37℃，5％co2。

②待293a细胞的汇合率大约在80％-90％时，跟换新鲜培养基，接种病毒，一个10cm皿接种300μl病毒上清液。

③细胞形态发生改变，从最初感染病毒时呈现多角状上皮细胞特性的293a细胞开始变圆，呈现葡萄串状的形态，并且在第六天时可看到大量细胞漂浮(约50％的细胞漂浮)，此时可进行收毒。

第一步，先吸出一部分上清液转移到无菌的15ml的离心管中，剩余的培养基反复吹打皿底未漂浮的细胞，将其同培养基一起转移到离心管中；

第二步，1000转，5min，离心收集上清液，分装到1.5ml的ep管中，1ml一管，置于-20℃保存；

第三步，加入1mlpbs重悬细胞；

第四步，用封口膜封住管盖，细绳绑住离心管，垂直将离心管放入液氮罐中，十多秒后不再听到液氮的沸腾声便可以取出；

第五步，将冻住的细胞液在37℃的温水中反复搅拌，使其快速融化；

第六步，步骤四和五重复三次；

第七步，13000转，10min离心收集上清液，分装到1.5mlep管中，每管0.5ml，置于-20℃保存。

第八步，步骤二中收集的上清液和步骤7细胞裂解液各取50μl，用于pcr检测基因组中目标基因的整合情况。

2.3pcr鉴定重组腺病毒中的目的基因

含有anp基因的腺病毒pcr鉴定体系(共25μl)

上清液和细胞裂解液中病毒检测pcr鉴定体系：rtaq酶0.2μl，上清液(细胞裂解液)2μl，anpsence0.25μl，anpanti0.25μl，dntp(2.5mm)2μl，10×buffer2.5μl，h2o17.8μl。

含有anp基因的腺病毒pcr鉴定程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃5min。pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳(如图3所示，1：水；2：ad-anp上清液；3：ad-anp细胞裂解液；4：ad-egfp上清液；5：ad-egfp细胞裂解液；6：pad-anp质粒作为阳性对照。大小为125bp的即为anp目的条带)

含有iganp基因的腺病毒pcr鉴定体系(共25μl)

上清液和细胞裂解液中病毒检测：rtaq酶0.2μl，上清液(细胞裂解液)2μl，igsence0.25μl，anpanti0.25μl，dntp(2.5mm)2μl，10×buffer2.5μl，h2o17.8μl。

含有iganp基因的腺病毒pcr鉴定程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃5min。pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳(如图4所示，1：pad-iganp质粒作为阳性对照；2：ad-egfp上清液；3：ad-egfp细胞裂解液；4：ad-iganp上清液；5：ad-iganp质粒包装所得的含有大量病毒的细胞裂解液；6：水。大小为196bp的即为iganp目的条带)

2.4腺病毒滴度快速测定法

①将293a细胞接种于96孔板中，每个孔约7000个细胞，以十二孔为一组测试一种病毒梯度，一种病毒重复三次，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；

②细胞汇合度为70％-80％时，跟换新鲜培养基，每孔90μl，加入病毒液。第一个孔加入10μl，轻吹混匀后，吸取10μl转入下一个孔，轻吹混匀后，按之前的步骤向后转移10μl，直到第11个孔，吸出的10μl直接丢弃。前四个稀释梯度可在1.5ml的ep管中进行，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；

③在倒置荧光显微镜下观察，从浓度高向低的方向顺序观察绿色荧光细胞的数量，当发现某一个孔之后的孔再无绿色荧光，则此孔作为计量孔(计为1u)，若在该孔前有个空没有绿色荧光，也将此孔作为计量孔，然后计算病毒的滴度。

病毒液的滴度＝(1u×计量孔相对于第1孔的稀释倍数)/第1孔加入病毒的体积。

10:1稀释的病毒滴度1u×10^n-1/0.01ml＝10ⁿ⁺¹u/ml，即当第8孔为计量孔时，病毒滴度＝10⁹u/ml。计算所得ad-anp、ad-iganp的滴度均为10⁹u/ml。

2.5重组腺病毒在scc9细胞中表达检测

总rna提取：

①将细胞接种于35mm皿中，37℃，5％co2培养24小时；

②细胞汇合度大约为80％时，跟换新鲜培养基，加入40μl病毒液(细胞裂解液)，轻摇混匀，37℃，5％co2培养48小时；

③总rna的提取

第一步，吸取培养基，用1×pbs洗涤1次，向皿中加入1ml的rnaisoplus(takara)，室温静置5min；

第二步，12000g，4℃，5min，收集上清液，转移到1.5ml的ep管中，加入约200μl氯仿；

第三步，涡旋震荡仪震荡混匀；

第四步，12000g，4℃，15min，收集上清液转移到新的ep管中，约有600μl；

第五步，加入600μl异丙醇；

第六步，室温静置10min后，12000g，4℃，5min，离心收集沉淀，丢弃上清液；

第七步，加入1ml无水乙醇，颠倒ep管洗涤沉淀；

第八步，12000g，4℃，5min离心后收集沉淀，丢弃上清；

第九步，将管子扣于无菌的滤纸上，使乙醇流干；

第十步，用20μl的free-rnaaseddh2o溶解rna。

④反转录获取cdna

第一步，配置反转录体系⑴：oligodtprimer(50μm)0.5μl，dntpmixture(10mm)0.5μl，模板rna1μg，rnasefreedh2o补足至5μl。

第二步，将体系⑴放于65℃保温，使rna的二级结构打开成一级结构，保温时间为5min，冰上迅速冷却；

第三步，配制反转录体系⑵：dnaseⅰ(70u/μl)0.2μl，primescriptⅱrtase(200u/μl)0.5μl，

rnaseinhibitor(40u/μl)0.25μl，5×primescriptⅱbuffer0.5μl，rnasefreedh2o3.55μl。

第四步，将该体系放置于42℃，30-60min(实际操作为40min)

第五步，95℃，5min使dnaseⅰ失活，冰上冷却。

cdna检测：pcr鉴定

第一步，含有anp基因的腺病毒pcr鉴定体系(共25μl)

上清液和细胞裂解液中病毒检测pcr体系：rtaq酶0.2μl，上清液(细胞裂解液)2μl，anpsence0.25μl，anpanti0.25μl，dntp(2.5mm)2μl，10×buffer2.5μl，h2o17.8μl。

含有anp基因的腺病毒pcr鉴定程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃5min。

含有iganp基因的腺病毒pcr鉴定体系(共25μl)

上清液和细胞裂解液中病毒检测：rtaq酶0.2μl，上清液(细胞裂解液)2μl，igsence0.25μl，anpanti0.25μl，dntp(2.5mm)2μl，10×buffer2.5μl，h2o17.8μl。

含有iganp基因的腺病毒pcr鉴定程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃5min。

细胞内参actin的检测：rtaq酶0.2μl，细胞裂解液2μl，qactinsence0.25μl，qactinanti0.25μl，dntp(2.5mm)2μl，10×buffer2.5μl，h2o17.8μl。细胞内参actin的pcr鉴定程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，16℃5min。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，如图5所示，在anp和ig-anp重组腺病毒感染scc9细胞后均有表达。

【实施例3】抑癌作用检测

1.细胞划痕实验

①细胞准备，将汇合度约为70％的60mm皿中的scc9细胞，按感染复数为100添加病毒(pfu约为1×10⁹的病毒添加30μl)，静置于37℃，5％co2培养箱中培养。

②预先用记号笔在12孔板的每个孔的底部画两道平行的线，将昨日60mm皿中的细胞用胰蛋白酶悬浮，一个汇合度大约为70％-80％的60mm皿可铺满4个12孔板的孔(感染病毒后的细胞生长缓慢，在70％汇合度的时候添加病毒不会导致铺板时细胞过多)，将铺好细胞的12孔板静置放于37℃，5％co2培养箱中培养；

③细胞划痕处理，取一把经过酒精灯灼烧处理后的铁尺，待其冷却后，放置于孔上，用手固定后，用带有200μl的枪头的移液器顺着铁尺在孔中划线，每个孔画一条线。画完后，弃上清培养基，沿壁添加1ml1×pbs，清洗划痕时产生的漂浮细胞，清洗大约1—3次，添加1ml1％血清含量的培养基，在倒置显微镜下拍下0h的划痕状态，固定拍摄划痕和事先记号笔画好的交叉处，将细胞静置放于37℃，5％co2培养箱中培养。每隔12-24小时拍照，持续三天(如图6所示，重组腺病毒表达anp和ig-anp组划痕愈合缓慢)；

④收集图片，用ipp(imageproplus)分析图片，获得各个组的细胞移动速率，取平均值后，将实验组与空白对照相除，获得实验组/对照组的比值，观察细胞的移动速率在不同时间段被抑制的状况(如图7)，anp和iganp都有较好的抑制舌癌细胞细胞scc9迁移的能力，其中iganp具有更好的抑制舌癌细胞细胞scc9迁移的能力。

2.mtt细胞相对活性检测

①准备细胞：细胞种类为scc9

使用血球计数板确定细胞浓度，保证96孔板中的细胞可以在第二天的汇合度为40％，scc9细胞为每孔5000个，每个孔的培养基为100μl。放于37℃，5％co2，培养24h。

②更换新鲜培养基，加入病毒液(细胞裂解液)，使用阿霉素作为阳性对照，放于37℃，5％co2，培养48h。

③每孔加入15μlmtt(5mg/ml，终浓度为0.75mg/ml)放置培养箱孵育4h。丢弃上清液，需要小心吸取，不可吸到甲瓒。加入150μldmso，摇床震荡10min。使用酶标仪检测，检测波长为570，得到数值后，计算抑制率。

抑制率＝(对照组的od570值-实验组的od570值)/对照组的od570值(如图8)，与egfp对照组相比，ad-anp和ad-iganp对scc9都有较高的抑制率。

3.细胞周期检测

①细胞铺板：实验前一天下午将细胞计数，细胞数量调整至1×10⁵/ml左右。将稀释好的细胞悬液均匀地铺到24孔板中，每孔500μl，大约50000个细胞。小心将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养过夜。

②添加病毒：分别向每孔添加20μl的ad-anp或ad-iganp，阴性对照为ad-egfp，置于培养箱培养48h。

③细胞固定：离心收集细胞，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次。先加300μlpbs将细胞重悬，再加入700μl预冷无水乙醇(最好是在-20℃预冷)使乙醇浓度为70％，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。

④细胞染色：离心收集细胞，以1ml的pbs洗细胞一次，加入80μlpbs含100μg/ml碘化丙啶(pi)，0.25％triton-100，4℃避光孵育30min。

⑤流式细胞仪检测：pi选用fl2通道检测。检测步骤用流式细胞仪按标准操作进行(如图9)。如图可知m1(g0/g1期的细胞所占百分比)与对照组相比明显增多，而m2(g2期细胞所占比例)与对照组相比减少，说明anp可以对细胞g0/g1期阻滞。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉生物工程学院

<120>一种利用anp或iganp基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用

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