本发明涉及核酸分子检测技术领域，尤其涉及一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法。
背景技术：
基因是指携带有遗传信息的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)碱基排列(序列)。从现代医学的角度出发，除外伤外，几乎所有的疾病都和基因有关系。因此，精准检测到基因序列信息，就意味着获取了任何生物类病原的最直接标签。人们对这一理念的高度认可刺激了上个世纪后期以来基因测序和基因诊断学的蓬勃发展和广泛应用。其中，基因诊断学是除了基因测序以外的所有基因检测方法的统称。
目前，医疗、检验检疫等单位使用最为广泛的基因诊断法是发明于1983年的热循环聚合酶链扩增反应(pcr)，但是pcr反应不能实现实时检测，为了更进一步的实现实验的可能性和最终实现现场即时检测(poct)，一系列的超灵敏等温放大技术得到发展，如用核酸序列为基础的扩增核酸依赖性扩增检测技术(nasba)、滚环扩增(rca)、解链酶扩增(had)、重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导等温扩增技术(lamp)等。其中，
lamp是一个极有效的等温核酸放大技术，它能在一个小时内将很少的目标基因片段放大到109倍，但是与此同时也会出现大量的非目标dna，因此检测它的目标产物变的十分困难。
面对以上症结，国内外先驱已基于前人建立的信号传导原理陆续提出“探针吸附法”、“探针累积法”和“序列特异识别法”三种解决办法。在前两种方法中，非目标产物通过自组装并不会被表现出来，例如在聚合过程中产生的焦磷酸离子，形成白色沉淀的焦磷酸盐，所以这些扩增产物可以被肉眼识别。另外，可以通过将染料钙黄绿素和羟基萘酚蓝扦插到核酸碱基对中来进行实时荧光检测。这种检测方法的弊端是由于随机的扦插产生假阳性信号。前两中方法的信号分别来源于扩增产物对小分子电化学探针(如亚甲基蓝和二茂铁等)产生的非特异性吸附和链增长累积，虽然足够灵敏，但这两种方法都只是识别核酸碱基对数目，而不是碱基排序，因此无法有效区分正确的扩增产物和非特异性的错误扩增副产物，频发假阳性误诊。
相比之下，“序列特异识别法”由于依赖扩增产物与其互补序列进行杂交，因此特异性高的多，基本可以排除假阳性误诊。为了提高检测的选择性，特异性的检测方法后续也有类似的方法，如pcr中加入taqman探针，近期也延伸到等温扩增技术中，尤其是环介导等温扩增技术。为了获得最高的杂交效率，序列特异性识别法的最佳检测对象是如环介导等温扩增技术等能生成单链环产物的反应。在所有的等温扩增中，环介导等温扩增技术是尤其的特异，因为它可以只利用一个聚合酶去扩增rna或dna模板达到109倍。通过交替延展和链置换反应，最终扩增出包含四种单链环序列的长茎环多联体。这些非杂交的环，通常15到35个碱基，可以作为下游序列特异性的信号探针输入口。而“序列特异识别法”的缺点是信号噪音偏高、单点突变分辨率差，当正确扩增产物被错误副产物稀释时，更会因检不出而频发假阴性误诊，且针对不同的待测物需重新设计探针序列，繁琐且增加检测成本和时间。
一步链置换(osd)方法相比杂交法更加具有特异性，而且更简单。在典型的osd反应中(如图1)，目标基因通常被叫做引发剂，被划分为两个单链的区域片段。短片段(域α，通常少于12个碱基)做为立足点(th)去绑定探针的互补粘性末端。随后，较长的片段叫做分支迁移域(bm，域2-3，通常多于16个碱基)触发一个分支迁移过程，最终取代探针中的阻滞链(域2-3)使其从荧光探针混合物中脱离。通常情况下，fam染料和淬光剂被标记在受体探针和阻滞链上。分解淬光剂后可以使荧光恢复从而观测osd过程。除了直接检测，更多的osd过程可以串联，形成不同类型的多步检测被叫为无酶核酸分子线路。
为了增大反应的敏感度和信号幅度，将osd反应从一步法到多步法，形成一个无酶分子线路，被称之为双发卡催化自组装(cha)反应。双发卡催化自组装(cha)是具有放大功能的分子线路之一。在一个典型的cha反应中(如图2)，引发剂(通常叫做c1)发生第一个osd反应打开一个h1链的发夹结构。因此，域3在h1链中做为立足点释放和另一个发卡结构h2链发生第二个osd反应，形成一个c1:h1:h2的中间体。因为c1与h1仅仅通过α-α*相互结合作用，所以c1会自动的分离出来，剩下h1:h2的混合物做为最终产物。分离出的c1可以继续使用不需要消耗，就像一个催化剂。为了监测cha反应，h1:h2可以设计成为触发另外一个osd反应，置换一个被淬光剂标记的链(简称q)脱离出fam标记的链(简称f)。
然而，所有这些反应都需要完全按照不同的lamp扩增产物去重新设计下游osd和cha组分或探针的序列，不但价格昂贵、设计复杂，而且存在较高的设计失败的风险，尤其是针对多元分析。
技术实现要素：
本发明提出了一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的多元分子检测方法，即在待测核酸发生等温扩增反应(lamp)的过程之中或之后，加入一条传导探针，与扩增产物中的一段核苷酸序列杂交形成引发剂，该引发剂会以形成三通核酸连接结构的方式引发下游的核酸分子线路(如osd或cha)，产生可以被检测到的荧光信号。这一发明的目的是在增加等温扩增的信号幅度和精准度的同时，提高单碱基突变检测的分辨率，且无需再根据不同的扩增产物设计特定的核酸分子线路探针(如cha中的h2与荧光探针)，即针对不同扩增产物的检测，只需要改变核酸分子线路cha组分中h1的α*域，无需改变h1的其他序列，并完全共享同样的h2序列和荧光探针。该方法在检测核酸分子时具有极高的普适性和可控性，检测更便捷，结果更可靠，可以实现单元分析、多元分析和半定量分析。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在一步链置换核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：
(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；
(2)：将核酸分子线路的各组分分别进行退火处理；
所述核酸分子线路为osd核酸分子线路，其组分包括受体探针、osd-f探针和osd-q探针；
(3)：将分子引发剂和核酸分子线路的各组分混合加热；
(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；
所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；
所述受体探针包含与目标核苷酸的α域碱基互补的可变域α*域、与传导探针的固定域2-3域碱基互补的固定域2*-3*域和固定域4*域；
所述osd-f探针依次包括与受体探针固定域2*-3*域碱基互补的固定域2-3域和3’端fam；
所述osd-q探针依次包括与受体探针固定域4*域碱基互补的固定域4域和5’端bhq1。
进一步地，在一步链置换(osd)核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为终点检测，所述方法包括以下步骤：
(1)将目标核苷酸和传导探针混合在1×tnak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂；
(2)将受体探针、osd-f探针和osd-q探针混合在1×tnak缓冲液中，并加入终浓度为2μm的(dt)21，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；
(3)将分子引发剂、受体探针、osd-f探针和osd-q探针等体积混合，加热到25～65℃保持2～3小时；
(4)检测荧光信号，每2分钟采一点，获得荧光检测曲线。
进一步地，在一步链置换(osd)核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为实时检测，所述方法包括以下步骤：
(1)制备目标核苷酸的等温扩增引物混合液；
(2)将受体探针、osd-f探针和osd-q探针混合在1×tnak缓冲液中，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；
(3)将受体探针、osd-f探针和osd-q探针等体积混合在1×tnak缓冲液中，并加入传导探针与目标核苷酸的等温扩增引物混合液，再加入bst2.0聚合酶，25℃-65℃保持4～5小时；
(4)检测荧光信号，每2分钟采一点，获得荧光检测曲线。
以及基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：
(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；
(2)：将核酸分子线路各组分分别进行退火处理；
所述核酸分子线路为cha核酸分子线路，其组分包括h1、h2、cha-f探针和cha-q探针；
(3)：将分子引发剂和核酸分子线路各组分混合加热；
(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；
所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；
所述h1依次包含与目标序列可变域α域碱基互补的可变域α*域、发卡结构固定域2*-3*-4-3-2和固定域5-6，其中2*-3*和3-2为碱基互补区域；
所述h2依次包含与h1碱基固定域碱基互补的固定域3*和发卡结构固定域4*-3-2-4域，其中4和4*为碱基互补区域；
所述cha-f探针依次包括5’端fam、与h1固定域5-6碱基互补的固定域6*-5*；
所述cha-q探针依次包括与h1固定域2碱基互补的固定域2*、与cha-f探针固定域5*-6*域互补的5-6域和3’端bhq1。
进一步地，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为终点检测，所述方法包括以下步骤：
(1)将目标核苷酸和传导探针混合在1×tnak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂；
(2)将h1、h2、cha-f探针和cha-q探针分别在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；
(3)将分子引发剂、h1、h2、cha-f探针和cha-q探针等体积混合在1×tnak缓冲液中，再加入终浓度为5mm的mg2+，37～60℃保持2小时；
(4)检测荧光信号，每3分钟采一个点，最终获得荧光检测曲线。
进一步地，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为实时检测，所述方法包括以下步骤：
(1)制备目标核苷酸的等温扩增引物混合液；
(2)将h1、h2、cha-f探针和cha-q探针分别在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；
(3)将h1、h2、cha-f探针和cha-q探针等体积混合在1×tnak缓冲液中，并加入传导探针与目标核苷酸的等温扩增引物混合液，再加入bst2.0聚合酶，37～60℃保持4～5小时；
(4)检测荧光信号，每3分钟采一个点，最终获得荧光检测曲线。
进一步地，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为多于一种，检测流程为终点检测，所述方法包括以下步骤：
(1)将多种目标核苷酸和传导探针混合在1×tnak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂；
(2)将h1、h2、cha-f探针和cha-q探针分别在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；
(3)将分子引发剂、h1、h2、cha-f探针和cha-q探针等体积混合在1×tnak缓冲液中，再加入终浓度为5mm的mg2+，37～60℃保持2小时；
(4)检测荧光信号，每3分钟采一个点，最终获得荧光检测曲线。
所述目标核苷酸至少为一个，所述传导探针至少为一个，所述目标核苷酸和所述传导探针一一对应，所述h1至少为一个，所述目标核苷酸和h1一一对应。
进一步地，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为多于一种，检测流程为实时检测，所述方法包括以下步骤：
(1)制备多种目标核苷酸的等温扩增引物混合液；
(2)将h1、h2、cha-f探针和cha-q探针分别在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；
(3)将h1、h2、cha-f探针和cha-q探针等体积混合在1×tnak缓冲液中，并加入多种传导探针与多种目标核苷酸的等温扩增引物混合液，再加入bst2.0聚合酶，37～60℃保持4～5小时；
(4)检测荧光信号，每3分钟采一个点，最终获得荧光检测曲线。
所述目标核苷酸至少为一个，所述传导探针至少为一个，所述目标核苷酸和所述传导探针一一对应，所述h1至少为一个，所述目标核苷酸和h1一一对应。
进一步地，所述目标核苷酸为寡核苷酸、寡核苷酸适配子、微小rna或者等温扩增产物。
进一步地，所述目标核苷酸的α域的碱基个数为10～14个；所述传导探针的固定域2-3域的碱基个数12～18个。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用一种三通连接结构去联接lamp扩增产物，将lamp扩增产物转化为特异性信号，检测的选择特异性可以通过两个特定的反应达到双保证，它们分别是t:tp的合成反应和t:tp-osd/cha的检测反应，因此可以获得高分辨率的基因单点突变检测；
(2)在扩大信号输出的同时，只需依照不同的目标核苷酸序列改变现有核酸分子线路中的α*域，如对于cha线路来讲，只需要改变h1的α*域，可完全保留h2与荧光探针的序列。这样，一套性能良好的osd线路或是cha线路可以很快的应用于新的目标核苷酸；通过三通连接结构连接不同检测目标基因的lamp扩增产物，可以统一与一个相同的设计好的cha线路相结合，共用一套荧光探针与h2链，只需要改变h1链的α域，，大大降低了成本及重新设计序列的风险；
(3)更重要的是，三通连接结构可以进行多元分析，只用一种信号方式去检测不同的目标基因，共享一个荧光探针，仅仅通过不同荧光值读数识别，实现单管单个检测通道来检测多种待测基因。在实施例中，可以明显区分两种不同的食源性细菌-阪崎肠杆菌和大肠杆菌，具有超高的灵敏性和选择特异性；
(4)本发明不仅大大节约了成本，而且不会产生副反应，避免了假阴性的出现；相比于其他等温扩增，还有很高的单点突变分辨率，因此更精准、更有效。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为典型的osd反应原理图；
图2为典型的cha反应原理图；
图3为本发明提供的形成分子引发剂结构的原理图；
图4为本发明提供的基于三通连接-osd核酸分子线路(3w-osd)结合的检测原理图；
图5为本发明提供的基于三通连接-cha核酸分子线路(3w-cha)结合的检测原理图；
图6为本发明实施例1和2提供的基于3w-osd和3w-cha检测tompa的荧光曲线图；
图7为本发明实施例3提供的基于3w-cha实时检测和基于3w-osd实时检测的荧光曲线图；
图8为本发明实施例3提供的基于3w-cha进行lamp扩增产物的终点检测荧光曲线图；
图9为本发明实施例4提供的单管单通道多元分析设计原理图；
图10为本发明实施例4提供的基于3w-cha探测器对三个目标t1、t2和t3的三次响应结果的荧光曲线图；
图11为本发明实施例4提供的单管单通道检测三种待测物t1、t2和t3的荧光曲线图；
图12为本发明实施例5提供的lamp扩增产物的凝胶图片；
图13为本发明实施例5提供的基于3w-cha单独检测lamp扩增ompa产物的荧光曲线图；
图14为本发明实施例5提供的基于3w-cha单独检测lamp扩增malb产物的荧光曲线图；
图15为本发明实施例5提供的基于3w-cha进行多元分析的荧光曲线图；
图16为本发明实施例5提供的在140分钟后基于3wj-cha检测的荧光照片。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。其中，t表示目标核苷酸；tp表示传导探针；t:tp表示分子引发剂；osd-a表示受体探针；3w-osd表示osd三通连接-核酸分子线路；osd-f表示osd反应中带有fam标记的信号探针；osd-q表示osd反应中标有quencher的信号探针；c1表示引发剂；h1表示第一发卡结构序列；h2表示第二发卡结构序列；3w-cha表示cha三通连接-核酸分子线路传导探针；cha-f表示cha反应中带有fam标记的信号探针；cha-q表示cha反应中标有quencher的第二信号探针；tpompa表示针对ompa基因的传导探针；tompa表示ompa基因扩增产物；h1ompa表示针对ompa基因的h1；tompa:tpompa表示针对ompa基因的分子引发剂；ti表示第一种目标核苷酸；t2表示第二种目标核苷酸；t3表示第三种目标核苷酸；tp-t1表示第一种目标核苷酸的传导探针；tp-t2表示第二种目标核苷酸的传导探针；tp-t3表示第三种目标核苷酸的传导探针；h1-t1表示第一种目标核苷酸的h1；h1-t2表示第二种目标核苷酸的h1；h1-t3、表示第三种目标核苷酸的h1；t1:tp1表示第一种目标核苷酸的分子引发剂；t2:tp2表示第二种目标核苷酸的分子引发剂；t3:tp3表示第三种目标核苷酸的分子引发剂。
实验原理：
为了改进并实现不同的检测目标，设计好一组osd三通连接-核酸分子线路传导探针或cha三通连接-核酸分子线路传导探针用于检测，本发明在引发剂上做了一个重要的变化。本发明将如图1所示的引发剂分成两段序列，分别是th域α和bm中域2-3，其中，将th域α嵌入在目标核苷酸t中，形成α-β域(如图3所示)，将bm中域2-3嵌入在一个设计好的传导探针tp序列中，形成β*-2-3域(如图3所示)。只有t和tp通过β-β*稳定杂交结合在一起时才可以使th域α和bm域2-3做为引发剂去发生osd或cha反应。也就是间接检测分子引发剂t:tp做为联结的引发剂而不需直接检测目标核苷酸t。由于t:tp:osd-a形成的osd三通连接-核酸分子线路(3w-osd)(如图4所示)或t:tp:h1形成的cha三通连接-核酸分子线路(3w-cha)(如图5所示)在反应中形成一个三通连接的结构，分别命名这两个三通连接结构为osd三通连接-核酸分子线路3w-osd和cha三通连接-核酸分子线路3w-cha。利用osd三通连接-核酸分子线路3w-osd和cha三通连接-核酸分子线路3w-cha可用于检测不同目标基因，只需要按照目标核苷酸t中域α的序列来置换受体探针osd-a或第一发卡结构序列h1中的域α*。对于osd三通连接-核酸分子线路传导探针3w-osd，本发明提供了一个双重osd探针(如图4所示)，分别是一个标有quencher的信号探针osd-q和一个带有fam标记的信号探针osd-f，其中接受探针osd-a的域4中完全与引发剂无关，它只与它的互补链中的域4*反应。当osd反应发生时，osd-f链置被换下来，使其有荧光信号。因此，所有对osd反应有影响的序列或昂贵的带标记的序列都没有变化。
基于此，本发明提供了一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在一步链置换核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：
(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；
(2)：将核酸分子线路的各组分分别进行退火处理；
所述核酸分子线路为osd核酸分子线路，其组分包括受体探针、osd-f探针和osd-q探针；
(3)：将分子引发剂和核酸分子线路的各组分混合加热；
(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；
所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；
所述受体探针包含与目标核苷酸的α域碱基互补的可变域α*域、与传导探针的固定域2-3域碱基互补的固定域2*-3*域和固定域4*域；
所述osd-f探针依次包括与受体探针固定域2*-3*域碱基互补的固定域2-3域和3’端fam；
所述osd-q探针依次包括与受体探针固定域4*域碱基互补的固定域4域和5’端bhq1。
以及提供了另一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：
(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；
(2)：将核酸分子线路各组分分别进行退火处理；
所述核酸分子线路为cha核酸分子线路，其组分包括h1、h2、cha-f探针和cha-q探针；
(3)：将分子引发剂和核酸分子线路各组分混合加热；
(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；
所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；
所述h1依次包含与目标序列可变域α域碱基互补的可变域α*域、发卡结构固定域2*-3*-4-3-2和固定域5-6，其中2*-3*和3-2为碱基互补区域；
所述h2依次包含与h1碱基固定域碱基互补的固定域3*和发卡结构固定域4*-3-2-4域，其中4和4*为碱基互补区域；
所述cha-f探针依次包括5’端fam、与h1固定域5-6碱基互补的固定域6*-5*；
所述cha-q探针依次包括与h1固定域2碱基互补的固定域2*、与cha-f探针固定域5*-6*域互补的5-6域和3’端bhq1。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
实施例1一步链置换(osd)核酸分子线路法单元终点检测方法
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在一步链置换(osd)核酸分子线路法单元终点检测中，所述方法包括以下步骤：
首先将目标核苷酸(如lamp扩增产物片段)和传导探针混合在1×tnak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂。同时制备osd核酸分子线路组分，用1×tnak缓冲液配制终浓度为50nm的osd-f，100nm的osd-q和100nm的受体的混合液，为了防止反应溶液吸附在塑料上，加入终浓度为2μm的(dt)21做为添加剂，并在受体混合液中加入终浓度为5mm的mg2+，加热到95℃保持5分钟，然后在降温速度为0.1℃/s下冷却至室温。下一步进行荧光信号检测，将分子引发剂加入到osd核酸分子线路组分混合液中，加热温度在55℃保持80min，并每两分钟读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线。其中，tompa(α_β)的序列为：
aagcgccgtttacagtgtc_gcctttatacggcatgcggccc
accepter(4_3*_2*_α*)的序列为：
taccatttttttc_gtaaatgcaccgc_ctcgacatgaagctactacacgacag_gacactgtaaacgg
osd-f(2_3_3’fam)的序列为：
ctgtcgtgtagta_gcttcatgtcgag_3’fam
osd-q(5’bhq1_4*)的序列为：
5’bhq1_gcggtgcatttacgaaaaaaatggta
tpompa(β*_tt_2_3)的序列为：
gggccgcatgccgtataaaggc_tt_ctgtcgtgtagta_gcttcatgtcgag
实施例2双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路单元终点检测方法
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路单元终点检测中，所述方法包括以下步骤：
将目标基因序列tompa与终浓度为80nm的传导探针tpompa混合，加热到95℃保持5分钟，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂；同时将cha核酸分子线路各组分h1ompa，h2和荧光探针混合物(包括200nm的cha-f和400nm的cha-q)在95℃保持5分钟，再在0.1℃/s下缓慢冷却到室温。将200nmh1ompa、800nmh2和200nm荧光探针混合物，等体积混合在1×tnak缓冲液中，并加入tompa:tpompa分子引发剂混合液，再加入终浓度为5mm的mg2，最终体积是20μl。取20μl中的17μl加入到384孔板中，在55℃下保持80分钟，每三分钟读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线。其中，
tompa(α_β)的序列为：
aagcgccgtttacagtgtc_gcctttatacggcatgcggccc
h1ompa(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
accaccgaacgc_catcatccagag_agaattatcgag_ccatcctcctaccc_ctcgataattct_ctctggatgatg_ccttgtcac_tacgcagcac
h2(3*_4*_3_2_4)的序列为：
agaattatcgag_gggtaggaggatgg_ctcgataattct_ctctggatgatg_ccatcctcctaccc
cha-f(5’fam_cga_6*_5*_2*)的序列为：
5’fam_cga_gtgctgcgta_gtgacaagg_catcatccagag
cha-q(5_6_tcg_3’bhq1)的序列为：
ccttgtcac_tacgcagcac_tcg_3’bhq1
tpompa(2_3_tt_β*)的序列为：
ctcgataattct_ctctggatgatg_tt_gcctgcgcccagctggct
参见图6所示，tompa:tpompa的混合物可以成功的触发osd和cha反应，并且都有显著的初始速度但非常不同的敏感度。对osd反应，释放fam(由最终的荧光强度表示)的浓度理论上是等于tompa的浓度。相对比下，对于cha反应，fam的最终释放浓度等于h1链和h2链其中更少的浓度(实施例2中是h1)。在cha反应中10nmtompa所产生的荧光信号是等同于在osd反应中50nm的tompa。因此，cha反应利用线性触发相比于osd反应可以放大10到百倍的放大倍数，灵敏度更高。
实施例3双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路单元实时检测方法
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路单元实时检测中，所述方法包括以下步骤：
实时检测和标准的lamp反应规则相同，只是加入了cha核酸分子线路组分h1ompa、h2和荧光探针的混合物。首先制备目标核苷酸的lamp引物混合液：用水配制终浓度都为20μm的ompa_bip和ompa_fip及终浓度都为5μm的ompa_b3和ompa_f3；下一步制备h1ompa溶液，h2溶液和荧光探针混合液，三个溶液都需要退火进行预折叠，加热到95℃保持5分钟，然后降温速度为0.1℃/s下冷却至室温；接下来将cha核酸分子线路各组分h1ompa溶液，h2溶液和荧光探针混合液等体积混合；制备反应所需的混合液，其中包括1μl的含有2000拷贝的人工合成基因，4μl的引物混合液，5μl的4mmdntps，1μl的100mm的mg2+，10μl的5mbetaine，80nm的tpompa，并加入终浓度为50nm的h1ompa，终浓度为200nm的h2，终浓度为50nm的荧光探针混合液(包括终浓度50nm的cha-f和终浓度为100nm的cha-q)，混合在终体积为50μl的1×等温缓冲液中(20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，2mmmgso4,0.1％tritonx-100，ph8.8)，加热温度在55℃保持280分钟，并每3分钟读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线。其中，
ompa_f3的序列为：
tggtcccagttccacgatac
ompa_b3的序列为：
gtaacccagtttagcggtca
ompa_fip的序列为：
ccaacgtacgggttaacctggtgacggtccgactcacgaa
ompa_bip的序列为：
tcgaaatgggctacgactggcttgtacgccctgagctttga
tpompa(2_3_tt_β*)的序列为：
ctcgataattct_ctctggatgatg_tt_gcctgcgcccagctggct
h1ompa(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
accaccgaacgc_catcatccagag_agaattatcgag_ccatcctcctaccc_ctcgataattct_ctctggatgatg_ccttgtcac_tacgcagcac
h2(3*_4*_3_2_4)的序列为：
agaattatcgag_gggtaggaggatgg_ctcgataattct_ctctggatgatg_ccatcctcctaccc
cha-f(5’fam_cga_6*_5*_2*)的序列为：
5’fam_cga_gtgctgcgta_gtgacaagg_catcatccagag
cha-q(5_6_tcg_3’bhq1)的序列为：
ccttgtcac_tacgcagcac_tcg_3’bhq1
参见图7所示，在反应大约50分钟后，ompa的2000个拷贝的样品开始显示上升的动能曲线，而阴性对照样本在反应300分钟后始终显示稳定状态的荧光。这表明了tp1ompatt可以成功与tompa结合嵌入在lamp扩增产物中，然后形成一个稳定的组合分子引发剂去触发3w-cha检测反应。在一个平行试验中，3w-osd核酸分子线路证明同样可以检测lamp扩增产物，但有很低的信噪比。
除了在lamp反应中作为一个实时检测器，3w-cha也可以应用到检测lamp反应结束后的扩增产物。参见图8所示，利用3w-cha做为终点检测器去检测lamp产物，发现与实时检测器得到的灵敏度和效率是相同的。通过lamp扩增放大可以将ompa低至20个拷贝目标基因都检测出。终点检测的优点在于检测不一定要在lamp反应的高温下，并且信号输出方式可以更灵活，可以被扩展到电化学、比色测量等。
实施例4双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法多元终点检测方法
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法多元终点检测中，所述方法包括以下步骤：
将人工合成的不同目标待测物终浓度都为5nm的t1，t2和t3溶液分别与终浓度为20nm的tpt1，tpt2和tpt3混合进行退火，加热到95℃保持5分钟，然后降温速度为0.1℃/s下冷却至室温；同时配制不同目标待测物所需的h1(h1t1，h1t2，h1t3)和共用h2与荧光探针混合物(cha-f和cha-q)。三种目标待测物的h1(h1t1，h1t2和h1t3)终浓度分别为200nm，300nm，400nm，h2终浓度为800nm，荧光探针混合物的终浓度为900nm(包括900nmcha-f和1.8μm的cha-q。h1t1，h1t2，h1t3和h2还有荧光探针混合物都需要分别预折叠，加热到95℃保持5分钟，然后降温速度为0.1℃/s下冷却至室温；将三种目标待测物的h1、h2和探针混合物等体积溶解在1×tnak缓冲液中，并加入终浓度为5mm的mg2+，加热温度在55℃保持120分钟，并每3分钟读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线。其中，
t1(β_α)的序列为：
catcactgtgagattctag_gactgactact
t2(β_α)的序列为：
ctactgataactgttctgactatc_gtgactctcta
t3(β_α)的序列为：
cttccattatagacttccactc_gtgagaaacct
tp-t1(2_3_tt_β*)的序列为：
cgacatct_aacctagc_tt_ctagaatctcacagtgatg
tp-t2(2_3_tt_β*)的序列为：
cgacatct_aacctagc_tt_gatagtcagaacagttatcagtag
tp-t3(2_3_tt_β*)的序列为：
cgacatct_aacctagc_tt_gagtggaagtctataatggaag
h1-t1(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
agtagtcagtc_gctaggtt_agatgtcg_ccatgtgtaga_cgacatct_aacctagc_ccttgtcat_agagcac
h1-t2(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
tagagagtcac_gctaggtt_agatgtcg_ccatgtgtaga_cgacatct_aacctagc_ccttgtcat_agagcac
h1-t3(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
aggtttctcac_gctaggtt_agatgtcg_ccatgtgtaga_cgacatct_aacctagc_ccttgtcat_agagcac
h2(3*_4*_3_2_4)的序列为：
agatgtcg_tctacacatgg_cgacatct_aacctagc_ccatgtgtagacha-f(5’fam_cga_6*_5*_2*)的序列为：
5’fam_cga_gtgctct_atgacaagg_gctaggtt
cha-q(c_5_6_tcg_3’bhq1)的序列为：
c_ccttgtcat_agagcac_tcg_3’bhq1
参见图9所示，本发明为三种不同寡核苷酸目标t(分别是t1、t2和t3)分别设计三组特异的序列tp(tp1、tp2和tp3)和cha中h1(分别是h1t1、h1t2和h1t3)，它们都是随机设计的并包含很少互相连接的序列。在接下来的cha反应中，这三组tp中域2-3是完全相同的，为了可以确保三个引发剂(t1:tp1、t2:tp2和t3:tp3)共享同一个h1(除了域α*)，h2和探针混合物(cha-f和cha-q)。
因为t1:tp1、t2:tp2和t3:tp3中域α的序列不同，所以cha反应会分别利用各自的引发剂触发反应并获得三重检测的效果(如图10所示)。多个单元信号探针或多个管子共用一种信号探针被不同浓度的h1检测不同t所替代。例如，h1t1的浓度是50nm，h1t2的浓度是75nm，h1t3的浓度是100nm。这些h1共享这总计225nm的h2和225nm的探针混合物。因此无论加入多少的t、t1、t2和t3分别释放到荧光为50nm，75nm和100nm的fam探针。因此，在这7种目标溶液(分别是空白，t1，t2，t3，t1+t2，t1+t3，t2+t3和t1+t2+t3)中，通过在3w-cha反应后读取不同的高荧光值(如图11所示)，可以区分识别不同的目标物。
实施例5双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法实际样品多元终点检测方法
实现简单快速的测试，甚至是poct检测，不仅依赖于简单的分子设计，还依赖于便携式信号装置。实现多元检测或逻辑检测的传统方法一般分为两类。一类是一管中不同通道进行多元分析检测，转化成不同的信号探针代表不同的颜色或氧化还原电位；另一类是多个管子一种通道去检测每一种样品。在这种情况下一种信号探针足够去检测所有的待测物。这两种方法都为便携式或商品化的装置留下了很好的技术需求。为了检测多种不同的目标核酸，本发明只需根据不同目标基因改变h1中域α*序列和tp中域β*序列，而用于检测的其他组分和序列没有改变。根据这个性质，本发明得到了3w-cha最好的优势，即在一个管子中利用一种信号通道检测多元样品，例如基因ompa与malb。
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在双发卡催化自组装(cha)多步核酸分子线路法实际样品多元终点检测中，所述方法包括以下步骤：
将样品ompa与malb的扩增产物取8μl与0.8μl的终浓度500nmtpompa和0.8μl的终浓度625nmtpmalb混合后加热到95℃保持5分钟，然后降温速度为0.1℃/s下冷却至室温；同时配制cha核酸分子线路各组分h1(h1ompa和h1malb)，h2和荧光探针混合物(1μmcha-f和2μmcha-q)，cha核酸分子线路各组分都需要分别预折叠，加热到95℃保持5分钟，然后降温速度为0.1℃/s下冷却至室温；然后等体积加入到扩增产物与tp的分子引发剂混合液中，加热温度在55℃保持120分钟，并每三分钟进行一次荧光强度采点，最终获得荧光检测曲线。其中，
h1ompa(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
accaccgaacgc_gatcacaccg_cagacgttga_ccacgctgctagca_tcaacgtctg_cggtgtgatc_ccttgtcata_cgcagcac
h1malb(α*_2*_3*_4_3_2_5_6)的序列为：
catgcccttctc_gatcacaccg_cagacgttga_ccacgctgctagca_tcaacgtctg_cggtgtgatc_ccttgtcata_cgcagcac
tpompa(2_3_tt_β*)的序列为：
tcaacgtctg_cggtgtgatc_tt_gcctgcgcccagctggct
tpmalb(2_3_tt_β*)的序列为：
tcaacgtctg_cggtgtgatc_tt_cctttgtaacaacctgtcatcgacah2(3*_4*_3_2_4)的序列为：
cagacgttga_tgctagcagcgtgg_tcaacgtctg_cggtgtgatc_ccacgctgctagca
cha-f(cga_6*_5*_2*)的序列为：
cga_gtgctgcg_tatgacaagg_gatcacaccg5’fam
cha-q(c_5_6_tcg)的序列为：
c_ccttgtcata_cgcagcac_tcg3’bhq1
ompa_f3的序列为：
tggtcccagttccacgatac
ompa_b3的序列为：
gtaacccagtttagcggtca
ompa_fip的序列为：
ccaacgtacgggttaacctggtgacggtccgactcacgaa
ompa_bip的序列为：
tcgaaatgggctacgactggcttgtacgccctgagctttga
malb_f3的序列为：
gccatctcctgatgacgc
malb_b3的序列为：
atttaccgcagccagacg
malb_fip的序列为：
cattttgcagctgtacgctcgcagcccatcatgaatgttgct
malb_bip的序列为：
ctggggcgaggtcgtggtattccgacaaacaccacgaatt
参见图12所示，在lamp反应后，样品中包含和不包含目标基因都加入到一个混合有40nmh1ompa和60nmh1malb的管子中。单元和多元的实验结果都在图13、14和15中列出来了。在图15中，荧光曲线的平台可以作为参考来判断目标基因的组成部分。当没有ompa或malb基因时，荧光平台在or线之下；当识别出存在ompa或malb基因时，荧光平台在or线和and线之间；当识别出同时存在ompa和malb两种基因时，荧光平台在and线之上。因此，这种检测方法可以定义为布尔型or逻辑或and逻辑。如图16所示，or逻辑的结果可以用肉眼通过蓝色光源激发获得的绿色识别。
在上述技术方案中，本发明提供的基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，灵敏度高、特异性好，可用于多元分子的检测。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
序列表
<110>中国科学院长春应用化学研究所
<120>基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法
<140>201711171462.x
<141>2017-11-22
<160>37
<170>siposequencelisting1.0
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cattttgcagctgtacgctcgcagcccatcatgaatgttgct42
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<213>探针(proboscidealouisianica)
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ctggggcgaggtcgtggtattccgacaaacaccacgaatt40