本发明涉及高通量测序
技术领域：
，具体而言，涉及一种检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针、试剂盒、测序文库及其构建方法。
背景技术：
：对于brca基因的检测方法，最早是在20世纪90年代使用一代sanger测序的方法，然而随着测序技术的发展，这一方法的缺点日益凸显，主要表现在通量小、成本高，很难满足大量样本的多基因测序分析。伴随着下一代测序技术(nextgenerationsequencing,ngs)的不断成熟应用，在临床应用的适用性也得到广泛认可，而且brca1/2基因本身非常大，突变广泛分布在基因的各个外显子及其调控区域，并且没有很明显的高频热点突变。如果采用一代sanger测序对brca1/2整个基因进行检测，需要消耗大量检测成本和时间成本；而ngs的目标区域捕获测序可以快速全面地检测brca1/2基因全部外显子、外显子内含子交接处的突变情况，foundationfocustmcdxbrca是第一个获得fda批准的以目标区域测序为技术的临床伴随诊断，该诊断就是针对brca1/2基因进行的全面筛查。目标序列捕获测序是通过技术手段将基因组特定的区域进行富集后建库测序，是提高检测灵敏度和特异性的重要手段。目前主流的目标序列捕获的方法主要有两种，液相杂交捕获法和多重pcr法。多重pcr法操作简便快速，但是由于引物设计的局限更适合捕获较小的区域，相比之下，液相杂交捕获法适合捕获较大的区域，更适合做基因全外显子的检测。目前基于illumina平台液相杂交捕获技术进行brca1/2基因检测的专利技术有：《一种用于乳腺癌易感基因brca1和brca2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法》，专利号cn106676169a；《基于高通量测序检测人brca1/2基因变异的质控方法及试剂盒》，专利号cn106381334a；《基于高通量测序检测人brca1/2基因的捕获探针及试剂盒》，专利号cn106319065a。其中《一种用于乳腺癌易感基因brca1和brca2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法》以150ngdna样本起始，采用了两次杂交捕获，增加了检测的复杂度和质控的不确定性，同时也增加了检测周期；《基于高通量测序检测人brca1/2基因变异的质控方法及试剂盒》和《基于高通量测序检测人brca1/2基因的捕获探针及试剂盒》使用的dna样本起始量为200ng，当样本较为珍贵的时候，低起始量准确检测成为可能需求。因此，如何提供一种能够以低于150ng的dna样本起始量来获得捕获效率较高的目的片段进行检测，目前还没有有效的解决办法。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针、试剂盒、测序文库及其构建方法，以解决现有技术中对人brca1/2基因突变进行检测时，对dna的样本起始量要求比较高的问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针，该特异性捕获探针包括如表1中seqidno:1至seqidno:241所示的序列。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测人brca1/2基因突变的试剂盒，试剂盒包括上述任一种特异性捕获探针。进一步地，特异性捕获探针为seqidno:1至seqidno:241所示的序列按等比例混合的混合物，优选特异性捕获探针的工作浓度为0.5pm-1.0pm。进一步地，试剂盒还包括接头封闭试剂。进一步地，接头封闭试剂包括seqidno:242和seqidno:243所示的序列。进一步地，试剂盒还包括文库封闭剂。进一步地，试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。进一步地，试剂盒还包括纯化相关试剂。根据本发明的另一方面，提供了一种检测人brca1/2基因突变的测序文库，测序文库通过采用上述任一种试剂盒构建而成。根据本发明的另一方面，提供了一种检测人brca1/2基因突变的测序文库的构建方法，构建方法采用试剂盒进行构建，试剂盒为上述任一种试剂盒。应用本发明的技术方案，本申请所提供的特异性捕获探针及试剂盒通过优化探针体系，能够实现以低至30ng的dna样本起始量，通过一次液相杂交捕获获得brca1/2基因目的区域的全部信息，且能够更灵敏地对各种类型(snp、insertion、deletion等)的突变进行检测。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。如
背景技术：
所提到的，现有技术中，在采用illumina平台液相杂交捕获方法进行brca1/2基因检测时，存在样本的dna起始量较高的缺陷，而当某些珍贵的样本量比较低时，目前的方法无法实现目的区域捕获的目的。为了改善这一状况，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针，特异性捕获探针包括如表1中seqidno:1至seqidno:241所示的序列。表1：本申请的上述探针序列通过对brca1/2整个基因的目标区域进行分区，每个分区进行120bp长度的探针设计，至少1次被探针覆盖。每条探针和全基因组进行比对(网址：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)，选取score值均为0的探针。选取的探针集再次比对brca1/2整个基因的目标区域，以确保目标区域全部覆盖。本申请的上述探针序列具有更高的特异性和均一性，每一条探针序列均是特异性结合到brca1/2的目标区域，而不能结合到全基因组上的其他区域。每条探针的长度均为120bp，更均一的探针长度使得探针和模板之间的结合温度更一致，从而提高了各条探针和模板结合的均一性，在杂交捕获温度一致的条件下增加了模板利用率。因而利用本申请所提供的检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针进行目的区域捕获时，对模板的起始量要求相应较低，在低于150ng的情况下即可完成覆盖整个brca1/2基因突变目的区域的捕获。在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种检测人brca1/2基因突变的试剂盒，该试剂盒包括上述提供的seqidno:1至seqidno:241的特异性捕获探针。该试剂盒提供的特异性捕获探针具有更高的特异性和均一性，每一条探针序列均是特异性结合到brca1/2目标区域，而不能结合到全基因组上的其他区域。每条探针的长度均为120bp，更均一的探针长度使得探针和模板之间的结合温度更一致，从而提高了各条探针和模板结合的均一性，在杂交捕获温度一致的条件下增加了模板利用率，因而该试剂盒实现了低起始量检测的目标。上述试剂盒中，特异性捕获探针为seqidno:1至seqidno:241所示的序列按等比例混合的混合物，优选特异性捕获探针的工作浓度为0.5pm-1.0pm。由于特异性捕获探针的末端具有生物素修饰，因此在后续杂交捕获之后，延伸后的片段可以连同杂交捕获得到的目的片段一起被带有链霉亲合素的磁珠所收集。随后的洗脱液可以将未被探针和特异引物捕获的片段冲洗掉。因而，进一步地，上述试剂盒中，除了包括上述捕获目的区域的特性捕获探针外，还可以包括其他的检测试剂，以使得检测更方便快捷。在本申请一种优选的实施例中，试剂盒还包括接头封闭试剂。此处的接头封闭试剂可以是现有市售的各种用于杂交捕获步骤之前的接头封闭试剂和文库中目的片段中的重复序列的封闭试剂，也可以是在此基础上进行适当改进得到的封闭试剂。在本申请一种优选的实施例中，接头封闭试剂包括seqidno:242和seqidno:243所示的序列。seqidno:242所示的接头封闭序列为p5接头的封闭序列，具体序列为：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcinverteddt。seqidno:243所示的接头封闭序列为p7接头的封闭序列，具体序列为：caagcagaagacggcatacgagatngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcinverteddt，其中n代表index的反向互补序列，n的数量可以是6、8或12。本申请所提供的上述试剂盒中的封闭试剂采用3’末端反向dt修饰的特异性封闭试剂进行文库接头封闭，该封闭试剂可以与接头头序列高效结合，减少了由于接头封闭不彻底造成的非特异性捕获，进一步提高了特异性捕获探针的捕获效率，从而降低对dna样本起始量的要求，实现了低起始量检测的目标。在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括文库封闭剂。用于提高杂交捕获之前对预扩增文库中目的插入片段的重复序列进行封闭，以提高捕获效率。在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括杂交清洗液和杂交增强剂。具体的杂交清洗液和杂交增强剂可以是现有市售试剂盒中的相关试剂。在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品的目的是作为阴性对照，在利用该试剂盒时，该阴性质控品中的检测结果为阴性，以确保操作过程无误。而阳性质控品的是指含有brca1/2基因突变的dna样品，可以是任何在brca1/2基因处为突变基因型的样品。阳性质控品的目的是作为阳性对照，在利用该试剂盒时，该阳性质控品中的检测结果为阳性，以确保操作过程无误。如果操作结果显示，阴性质控品的结果为阳性，或者阳性质控品的结果为阴性，均能表明此处操作过程存在失误，结果不可信。在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括纯化相关试剂。纯化相关试剂包括与探针特异性结合的磁珠及磁珠清洗液，清洗缓冲液等。在本申请一种更优选的实施例中，提供了一种具体如下表2所示成份及其数量和储存温度的试剂盒。表2：上表2中，接头封闭剂1的序列如seqidno:242所示，接头封闭剂2-1至接头封闭剂2-24的序列如seqidno:243所示，不同的是，接头封闭剂2-1至接头封闭剂2-24中的标签(index)封闭剂的序列各不相同，且与各自对应的index序列反向互补。在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种检测人brca1/2基因突变的测序文库，测序文库通过采用上述任一种试剂盒构建而成。采用本申请的试剂盒构建而成的测序文库中，目的区域片段的占比较高，可以高达60％～70％。在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种检测人brca1/2基因突变的测序文库的构建方法，该构建方法采用试剂盒进行构建，试剂盒为上述任一种试剂盒。采用本申请的试剂盒构建而成的测序文库中，目的区域片段的占比较高，可以高达60％～70％。具体地，上述测序文库的详细构建方法如下：1)探针的设计和制备对brca1/2整个基因的目标区域进行分区，每个分区进行120bp长度的探针设计，至少1次被探针覆盖。每条探针和全基因组进行比对(网址：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)，选取score值均为0的探针。选取的探针集再次brca1/2整个基因的目标区域，确保目标区域全部覆盖。2)封闭试剂的使用根据文库接头中不同的标签序列(index)，使用对应的接头封闭试剂对文库进行封闭。3)使用探针和杂交捕获试剂进行目的片段的捕获和洗脱将以上合成的探针进行等比例混合，最终的浓度为0.5pm-1.0pm使用。由于特异引物末端具有生物素修饰，因此在后续杂交捕获之后，延伸后的片段可以连同杂交捕获得到的目的片段一起被带有链霉亲合素的磁珠所收集。随后的洗脱液可以将未被探针和特异引物捕获的片段冲洗掉。4)捕获片段的pcr扩增无论是被杂交探针还是特异引物捕获下来的目的片段两端都已经连接上illumina平台测序所需的接头，因此使用通用p5/p7引物将目的片段进行扩增。5)上机测序将构建的捕获文库使用illumina测序平台进行上机测序，得到原始测序数据。6)信息分析使用杂交捕获信息分析流程，对原始测序数据进行质控参数的分析，包括目标区域覆盖度、平均测序深度、捕获效率和均一性等。下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。实施例1采用不同样本起始量来检测brca1/2基因变异结果，具体样本信息见表3。表3：上述全血样本进行提取，进行定量后精确计算拷贝数，根据拷贝数等比例混合上述样本后获得测试样本，测试样本的理论突变值为商业试剂盒(agilentsureselectqxtreagentkit，厂商：安捷伦，货号：g9681b))测试结果。具体所用到的试剂和仪器见表4。表4：操作流程：1)捕获前文库构建：分别取30ng、50ng、100ng、150ng、200ng测试样本dna打断成200-300bp的片段，使用通用基因测序用文库试剂盒，按照试剂盒说明书进行捕获前文库的构建，并对文库进行纯化和qubit定量。2)液相杂交捕获2.1捕获探针的准备合成的探针进行等比例混合，最终工作液的浓度为0.75pm使用，放置于冰盒内。2.2分别取制备的捕获前文库各400ng，命名为样本1和样本2，每份样本分别加入5μl文库封闭剂和1μl接头封闭剂1，对应index的4μl接头封闭剂2，涡旋混匀，将上述混合液真空抽干。2.3将上一步骤中烘干的混合物加入8.5μl杂交缓冲液，2.7μl杂交增强剂和1.8μl无rna酶水(nuclease-freewater)，颠倒混匀并在室温放置5～10min；2.4将混合物转移到0.2ml的pcr管中，95℃孵育10min；2.5在室温条件下，各文库加入1μl探针，涡旋混匀，并瞬时离心。再在pcr仪上65℃孵育4h(pcr仪的加热盖设置为75℃)。2.6按照表5所示的配方准备洗脱缓冲液(1×)。表5：注意：洗脱缓冲液配制前要提前在室温放置2h。2.7按照表6所示的缓冲液及程序进行孵育。表6：溶液1×洗脱缓冲液工作温度清洗缓冲液1100μl65℃清洗缓冲液1200μl室温(15–25℃)增强清洗缓冲液400μl65℃2.8磁珠的准备a.从4℃冰箱取出dynabeadsm-270streptavidin磁珠，涡旋15s，在室温下放置30min左右。b.在每个200μlep管内加入100μl磁珠，在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；c.加入200μl磁珠清洗液，并涡旋混匀10s。在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；d.重复步骤3；e.加入磁珠清洗液，在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清。2.9链霉亲和素磁珠吸附杂交捕获目标区域将2.5的产物转移到步骤2.8-e中的ep管内，颠倒混匀10次；在热循环仪上(盖子温度设为75℃)进行65℃孵育45min，其中每隔12min涡旋3s。2.10冲洗链霉亲和素磁珠以去除未结合的dnaf.加入100μl65℃预热的清洗缓冲液1，涡旋混匀并瞬时离心；g.在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；h.加入200μl增强清洗缓冲液,颠倒混匀10次，并于65℃孵育5min；i.在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；j.重复步骤h和i。k.加入200μl常温孵育的清洗缓冲液1，涡旋混匀2min，并瞬时离心；l.在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；m.加入200μl常温孵育的清洗缓冲液2，涡旋混匀1min，并瞬时离心；n.在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；o.加入200μl常温孵育的清洗缓冲液3，涡旋混匀30s，并瞬时离心；p.在磁力架吸附至溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清。q.将上步ep管转移到试管架上，并加入20μlnfw，上下颠倒混匀10次以重悬磁珠。3)杂交捕获后的pcr扩增3.1.pcr反应试剂的配制表如下表7。表7：反应体系体积(μl)聚合酶25引物混合液5带有dna的磁珠(来自步骤3)20总体积50将配制好的pcr混合物涡旋混匀，并瞬时离心；3.2按照以下表8所示的pcr反应程序进行pcr反应。表8：4)扩增后的纯化4.1加入75μl(1.5×)vahtsdnacleanbeads到每个pcr扩增管内，涡旋混匀，并常温孵育10min；4.2磁力架吸附5min，待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清；4.3加入200μl80％乙醇漂洗dna，在磁力架上静置30s，用枪头吸取丢弃上清；4.4重复上一步；4.5瞬时离心，待乙醇收集至管底，吸净管底残留的液体，室温晾干5-10min；4.6加入22μlnfw，涡旋混匀，室温静置5min；4.7瞬时离心，吸取20μl液体至新的ep管内；5)文库质控采用vahtstmlibraryquantificationkitfor试剂盒进行定量杂交捕获的dna浓度，采用aglient2100对文库片段进行检测。6)使用illuminanextseq550测序仪进行文库的测序。7)使用生物信息分析流程，对原始数据的捕获质控信息进行分析。突变检出结果如下表9。表9：表10：目标区域覆盖度、平均测序深度、捕获效率和均一性的检测结果从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过提供具有更高特异性和均一性的针对人brca1/2基因的特异性捕获探针混合物，其中每一条探针序列均是特异性结合到brca1/2目标区域(而不结合到全基因组上的其他区域)，且每条探针的长度均为120bp，更均一的探针长度使得探针和模板之间的结合温度更一致，从而提高了各条探针和模板结合的均一性，在杂交捕获温度一致的条件下增加了模板利用率，因而降低了对模板起始量的要求，实现了低起始量检测的目标。本申请提供的能够用于低dna起始量检测brca1/2基因突变的探针和试剂盒，试剂盒中除了包括探针外，还包括杂交捕获之前的封闭试剂，本申请提供的封闭试剂采用3’末端进行反向dt修饰的特异性p5和p7接头封闭试剂。该封闭试剂对文库接头具有更高的结合效率，同时可减少因接头连接导致的非目标区域捕获，index特异性封闭降低了封闭序列对后续pcr过程的影响。提高了捕获效率，进一步提高了模板的利用率。由此可见，本申请的试剂盒使用的探针长度更加均一，具有更好的结合效率，并且有高度的特异性，使得样本的模板利用率更高。通过探针和接头封闭试剂两方面的优化，使本试剂盒能够在低至30ng的样本起始量条件下准确检出brca各类型突变。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>天津诺禾致源生物信息科技有限公司<120>检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针、试剂盒、测序文库及其构建方法<130>pn79198nhzy<160>243<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1tgctacactgtccaacacccactctcgggtcaccacaggtgcctcacacatctgcccaat60tgctggagacagagaacacaagcagagattagtgtcaattcattctcctggactaggctc120<210>2<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2tatagcacaggtacatgcaggcaccttaccatggaagccattgtcctctgtccaggcatc60tggctgcacaaccacaattgggtggacaccctggatccccaggaaggaaagagcattcaa120<210>3<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>3tccatagggactgacaggtgccagtcttgctcacaggagagaatattgtgtcctccctct60ctgacagggcacccaatacttactgtgccaagggtgaatgatgaaagctccttcaccaca120<210>4<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>4gaagcaccacacagctgtaccatccattccagttgatctaaaatggacatttagatgtaa60aatcactgcagtaatctgcatacttaacccaggccctctaccctacactctccggatgaa120<210>5<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>5aaaaatccaattgataactaataaagaggatggaaacaaaattacattgcagccaggttt60tcttgctgtcactcatctgcctgtgaccagatgctaaggcctttctctaaggtgtaagag120<210>6<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>6tgctggaactctggggttctcccaggctcttacctgtgggcatgttggtgaagggcccat60agcaacagatttctagccccctgaagatctggaagaagagaggaagagagagggacaggg120<210>7<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>7cggcccatctctgcaaaggggagtggaatacagagtggtggggtgagatttttgtcaact60tgagggagggagctttacctttctgtcctgggattctcttgctcgctttggaccttggtg120<210>8<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>8gtttcttccattgaccacatctcctctgacttcaaaatcatgctgaaagaaaccaaacac60aacccatcaggataagagaaagagaagcttccttcaatggaagtggagcagacacgtcat120<210>9<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>9atgaatatctctggttagtttgtaacatcaagtacttacctcattcagcatttttctttc60tttaatagactgggtcacccctaaagagatcatagaaaagacaggttacatacagcagaa120<210>10<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>10accttaggtgttaaacgttaggtgtaaaaatgcaattctgaggtgttaaagggaggaggg60gagaaatagtattatacttacagaaatagctaactacccattttcctcccgcaattccta120<210>11<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>11gaaaatatttcagtgtccgttcacacacaaactcagcatctgcagaatgaaaaacactca60aaggattagaagttgaaaacaaaatcaggaagtgctgtcctaagaagctaaagagcctca120<210>12<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>12gcatgcgccaccgtgcctcgcctcatgtggttttatgcagcagatgcaaggtattctgta60aaggttcttggtatacctgttttcataacaacatgagtagtctcttcagtaattagatta120<210>13<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>13gttaaagtgatgtggtgttttctggcaaacttgtacacgagcatctgaaattaaatcaaa60tattccattatcatgagttacctctagcacacagctcagaatactagttattccaccatg120<210>14<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>14tattaattgacaatacctacataaaactctttccagaatgttgttaagtcttagtcatta60gggagatacatatggatacactcacaaattcttctggggtcaggccagacaccaccatgg120<210>15<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>15acattcttttgttgaccctttctgttgaagctgtcaattctggcttctccctgctcacac60tttcttccattgcattatacccagcagtatcagtagtatgagcagcagctggactctggg120<210>16<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>16cagattctgcaactttcaattggggaactttcaatgcagaggttgaagatggtatgttgc60caacacgagctgactctggggctctgtcttcagaaggatcagattcagggtcatcagaga120<210>17<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>17agaggctgattccagattccaggtaaggggttccctctgaaaggaatgggagaagtttaa60tttacacaacgatgaatgttgaattacaaagttctggtctctgttaagaattaaaaagac120<210>18<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>18taaaagttggttaaccagaatatctttatgtaggattcagagtaaaatcaaagtgtttgt60tccaatacagcagatgaaatattacctagatcttgccttggcaagtaagatgtttccgtc120<210>19<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>19aaatcgtgtggcccagactcttccagctgttgctcctccacatcaacaaccttaatgagc60tcctcttgagatgggtagtttctattctgaagactcccagagcaactgtgcatgtaccac120<210>20<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>20ctatcatctaatgatgggcatttagaaggggatgacctagaaagataaatggaaggagaa60aaccatcgccaccaattgtgaaaggacaaatcatacttgctgggcagccaaagcataaat120<210>21<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>21gttcaatataaataaagatgtcagataccacagcatctttacattgatgtttcttacctt60tccactcctggttctttatttttactggtagaactatctgcagacacctcaaacttgtca120<210>22<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>22gcagaaaggccttctggattctggcttatagggtattcactacttttctgtgaagttaat60actgctttaaatggaatgagaaaacaaatctactttactgctttgttctgatagtgataa120<210>23<211>120<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>23cttaagatatcagtgtttggccaacaatacacacctttttctgatgtgctttgttctgga60tttcgcaggtcctcaagggcagaagagtcacttatgatggaagggtagctgttagaaggc120<210>24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