一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA的制作方法

本发明涉及dna提取
技术领域：
，具体涉及一种改良ctab法提取棉花基因组dna。
背景技术：
：近年来，随着作物数量性状基因位点定位研究的深入开展，分子标记技术越来越广泛地被科研和育种单位应用于作物标记辅助育种。在作物标记辅助育种程序中，高通量、快速、低成本提取作物单株的dna一直是科研和育种者的理想目标。在棉花分子标记辅助选择工作中，一般是从棉株叶片中提取dna样品，与其他植物的dna提出不同的是，棉花叶片中除富含蛋白外，还含有较多的棉酚、多糖、单宁等次生代谢物，这些代谢物在细胞破裂时容易氧化，氧化后与蛋白质、核酸等发生不可逆反应，形成棕色胶状复合物，影响后续的实验工作，因此导致棉花叶片dna提取的步骤较其他作物更为复杂。目前，常用的棉花叶片dna提取方法是ctab法。这种方法包括田间取样、组织破碎、提取缓冲液预处理、裂解缓冲液裂解细胞、去除蛋白质及rna等杂质、沉淀dna、漂洗dna和溶解等环节。但是，传统的ctab法，在对棉花基因组中rna进行清除时，需要将dna溶解后再抽提一遍，这使提取步骤变得十分繁琐复杂，耗时长且dna得率低。也有实验室采用商品化的试剂盒提取棉花叶片dna，商品化的试剂盒一般是在solutioni中添加rnasea，过柱前就将rna切成小片段，而且rna相较基因组dna普遍偏小，过柱时无法挂到柱上，因此得以除去rna。商品化的试剂盒虽然rna去除效果好，耗费时间短，但是造价高昂，并不适合大批量的材料处理。近几年来，国内外对基因组测序研究愈加重视，各国都加大了研究投资力度。但基因组测序对基因组dna的质量要求高，rna的存在严重影响了基因组测序的质量，并且往往需要在短时间处理大量的样本，因此需要一种精简清除rna的植物基因组提取方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种改良ctab法提取棉花基因组dna，用以解决现有的dna提取方技术步骤繁琐，且rna去除耗时长的技术问题。为实现上述目的，本发明的技术方案为一种改良ctab法提取棉花基因组dna，包括以下步骤：（1）取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入ctab缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min轻轻摇动，得到含有dna的提取液i；（2）将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，加入rnasea后进行水浴；（3）向反应后的dna的提取液i中加入等体积的溶液a振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液i；所述溶液a由氯仿：异戊醇按照24:1的体积比混合而成；（4）向上清液i中加入等体积的溶液a，振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液ii；（5）向上清液ii中加入0.1倍体积的3mnaac，然后缓慢加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，水平摇动离心管5min形成絮状沉淀；（6）于10000r/min、4℃下离心5min，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗沉淀一次，弃去无水乙醇，干燥得沉淀dna；（7）溶解沉淀dna，保存于-20℃冰箱中备用。优选的，步骤（1）中，所述材料选用陆地棉的叶片。优选的，步骤（1）中，所述材料与ctab缓冲液按照m:v为1~2:10进行混合。优选的，步骤（1）中，所述ctab缓冲液中含有：1.4mnacl，0.02medta，0.1mtris-hcl，2%十六烷基三甲基溴化铵，2%pvp-k30，0.1%dieca，0.2%β-巯基乙醇，溶剂为去离子水；其中，β-巯基乙醇用时现加。优选的，步骤（2）中，将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，按照体积百分比向dna的提取液i中加入0.25％~1％的rnasea，然后于27~37℃水浴条件下反应7.5~60min。优选的，步骤（2）中，将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，按照体积百分比向dna的提取液i中加入0.5％的rnasea，然后于37℃水浴条件下反应7.5min。优选的，步骤（2）中，将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，按照体积百分比向dna的提取液i中加入0.25％的rnasea，然后于37℃水浴条件下反应7.5min。优选的，步骤（7）中，用100μl灭菌超纯水溶解沉淀dna。优选的，步骤（7）中，用50~100μlte缓冲液溶解沉淀dna；所述te缓冲液中含有1mtriscl，0.5medta，溶剂为去离子水，所述te缓冲液溶的ph为8.0。本发明提供了一种改良ctab法提取棉花基因组dna，其利用ctab溶液在不同温度下裂解能力的差异发挥rnasea的作用，清除基因组dna中存在的rna，简化植物基因组rna清除过程。本发明方法具有如下优点：（1）相较于现有的提取方法中先完成dna提取后再单独进行rna清除，本发明反其道而行之，减少了操作步骤和程序，节约了成本，大大缩短了dna的提取时间，加快了实验进度。（2）本发明将rnasea消化提前，无需对提取完成的dna再进行消化和抽提，并且减少了提取液的抽提次数和dna沉淀的洗涤次数，保证了dna的得率。（3）本发明的rna消除效果好，获得的dna质量高且稳定，有利于后续的实验研究。（4）本发明的改良ctab法不光适用于棉花叶片基因组中rna的消除，也可用于棉花、玉米、小麦、大豆、水稻、烟草等其他作物。本发明精简了ctab法提取棉花叶片基因组dna的步骤程序，大大缩短了实验时间，还降低了dna提取成本，提高了rna的消除效果，适合棉花叶片基因组dna的大批量提取。附图说明图1为本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为天根dp320试剂盒提取陆地棉叶片基因组dna，泳道2~6中rnasea的水浴温度分别为22℃、27℃、32℃、37℃、65℃；图2为本发明实施例3的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为天根dp320试剂盒提取陆地棉叶片基因组dna，泳道2~6中rnasea的消化时间分别为2h、1h、0.5h、15min、7.5min；图3为本发明实施例4的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1~6中rnasea的使用量分别为1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.03125%（v/v）。图4为本发明实施例5的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1~3为通过实施例4方法获得的陆地棉叶片基因组dna，泳道4~6为通过实施例5方法获得的陆地棉叶片基因组dna；图5为本发明的实施例6~10的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1~5分别为玉米、小麦、大豆、水稻、烟草的基因组dna。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1陆地棉叶片的基因组dna提取一种改良ctab法提取棉花基因组dna，包括以下步骤：（1）以陆地棉的叶片作为实验材料，取100~200mg试样装入2.0ml离心管中，用液氮研成粉末，然后加入1000μl的ctab缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min轻轻摇动，得到含有dna的提取液i。所述粉末与ctab缓冲液按照m:v为1~2:10进行混合。所述ctab缓冲液中含有：1.4mnacl（氯化钠），0.02medta（ph8.0），0.1mtris-hcl（ph7.5），2%（w/v）十六烷基三甲基溴化铵（ctab），2%（w/v）pvp-k30，0.1%（w/v）dieca，0.2%（v/v）β-巯基乙醇，溶剂为去离子水，其中，β-巯基乙醇现用现加。（2）将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，加入rnasea后进行水浴。（3）向反应后的dna的提取液i中加入等体积的溶液a振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液i；所述溶液a由氯仿：异戊醇按照24:1的体积比混合而成。（4）向上清液i中加入等体积的溶液a，振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液ii。（5）向上清液ii中加入0.1倍体积（即占上清液ii的1/10体积）的3mnaac（ph5.2），然后缓慢加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇（即无水乙醇是上清液ii与naac体积之和的2倍），水平转动离心管5min形成絮状沉淀。（6）于10000r/min、4℃下离心5min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，弃去无水乙醇，在真空干燥机中干燥或晾干得沉淀dna。（7）用100μl灭菌超纯水溶解沉淀dna，保存于-20℃冰箱中备用。该步骤中，也可用50~100μlte缓冲液溶解沉淀dna。所述te缓冲液中含有1mtriscl，0.5medta，溶剂为去离子水，所述te缓冲液溶的ph为8.0。实施例2rnasea作用温度的确定准备多份陆地棉叶片材料，采用实施例1的方法提取陆地棉叶片的基因组dna。其中，在步骤（2）中，将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，分别加入1%（v/v）的rnasea（购自宝生物公司，规格是10mg/ml），然后分别在22℃、27℃、32℃、37℃、65℃的水浴条件下消化2h。配置0.8％的琼脂糖凝胶，用1×tae电泳缓冲液对提取的基因组总dna进行电泳检测，所述1×tae电泳缓冲液组成如下：0.04mol/ltris-乙酸，0.001mol/ledta。以试剂盒提取陆地棉叶片基因组dna（天根dp320）作为对照，与上述温度梯度实验获得的陆地棉叶片基因组dna一起进行琼脂糖凝胶电泳。吸取基因组dna5μl，和1ul的6×上样缓冲液(宝生物公司生产)混合，混合均匀后，按照15v/cm稳压电泳30分钟，电泳结束后用凝胶成像系统来观察，结果见图1。如图1所示，通过本发明的改良ctab法获得的基因组dna条带清晰完整，能够达到试剂盒提取的效果，并且，在27~37℃下，rna酶作用效果良好，尤其在37℃时，rna去除效果最好，完全看不到弥留的rna条带。实施例3rnasea作用时间的确定准备多份陆地棉叶片材料，采用实施例1的方法提取陆地棉叶片的基因组dna。其中，在步骤（2）中，将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，分别加入1%（v/v）的rnasea，然后分别在37℃的水浴条件下消化2h、1h、0.5h、15min、7.5min。以试剂盒提取陆地棉叶片基因组dna（天根dp320）作为对照，与上述rnase不同消化时间作用下获得的陆地棉叶片基因组dna一起进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。如图2所示，1%（v/v）浓度的rnasea在37℃条件下水浴反应7.5min足以充分消化基因组中的rna。实施例4rnasea作用浓度的确定准备多份陆地棉叶片材料，采用实施例1的方法提取陆地棉叶片的基因组dna。其中，在步骤（2）中，将盛有dna的提取液i离心管放置冰中降温后，分别加入1%（v/v）、0.5%（v/v）、0.25%（v/v）、0.125%（v/v）、0.0625%（v/v）、0.03125%（v/v）的rnasea，然后分别在37℃的水浴条件下消化7.5min。将上述不同rnasea添加量下获得的陆地棉叶片基因组dna一起进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。如图3所示，0.25%（v/v）rnasea以下浓度无法完全消化基因组中的rna。因此得出，rnasea消化的最优条件：即在dna的提取液i中加入0.25%（v/v）rnasea在37℃下水浴7.5min。由此可见，改良ctab法不仅减少了反应步骤，并且节省了rnasea的使用量，缩短了消化时间，从而降低了样本处理成本，提高了样本处理效率。本发明推测，改良的ctab法在rna消化过程中，因为裂解液将细胞壁破碎，植物细胞的内源性rnasea随之释放出来，与外源添加的rnasea进行协同作用，从而降低了外源性rnasea的使用量，并缩短了rna消化时间。实施例5对比实施例一种改良ctab法提取棉花基因组dna，包括以下步骤：（1）取材料，用液氮研成粉末。（2）将研磨号的粉末移入离心管，加入ctab缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min轻轻摇动，得到含有dna的提取液i。（3）向反应后的dna的提取液i中加入等体积的溶液a振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液i；所述溶液a由氯仿：异戊醇按照24:1的体积比混合而成。（4）向上清液i中加入等体积的溶液a，振荡混匀3min，10000r/min离心10min，得上清液ii。（5）向上清液ii中缓慢加入0.6倍体积的-20℃预冷的异丙醇，水平摇动离心管，沉淀30min。（6）于10000r/min、4℃下离心5min，弃上清，用70%乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗沉淀一次，弃去无水乙醇，干燥得沉淀dna；（7）溶解沉淀dna，形成dna溶解液i。（8）向dna溶解液i中加入1%（v/v）rnasea，37℃水浴2h。（9）向dna溶解液i加入等体积的溶液a，振荡混匀3min，10000r/min离心10min，得上清液iii。（10）向上清液iii中加入0.1倍体积的3mnaac，然后缓慢加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，水平摇动离心管5min形成絮状沉淀。（11）于10000r/min、4℃下离心5min，弃上清，用70%乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗沉淀一次，弃去无水乙醇，干燥得沉淀dna。（12）溶解沉淀dna，保存于-20℃冰箱中备用。分别取3个由本实施例（传统的ctab法）制备的陆地棉叶片基因组dna以及由上述实施例4（rna消化条件为：在dna的提取液i中加入0.25%（v/v）rnasea在37℃下水浴7.5min）制备的陆地棉叶片基因组dna作为对照组，进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。如图4可知，传统的ctab法以及本发明的改良ctab法都可以将棉花叶片基因组dna中的rna去除干净，但是，改良的ctab法获得的基因组dna的条带亮度不弱于传统ctab法获得的基因组dna条带。使用超微量分光光度计(型号：eppendorfbiophotometerplus)将本发明实施例4的改良ctab法提取的棉花叶片dna与实施例5（传统的ctab法）提取的棉花叶片dna进行了浓度测定，并对两种提取dna的方法进行了dna浓度、耗时和成本的比较，结果见表1。表1.两种方法提取的陆地棉叶片基因组dna样品浓度的比较提取方法浓度（ng/ul）耗时（小时/实验）改良法300±202传统法200±205从表1中可以看出，利用本发明改良ctab法提取的dna样品的含量与现行传统的ctab法提取的棉花dna的含量相比有50%的提高；并且相对于传统的ctab法，每组样本的处理时间节约了3个小时之多；而且由于减少了一次抽提步骤和3次沉淀洗涤次数，rnasea的用量及消化时间也少，减少了试剂盒酶的使用量，从而节约了提取成本。本发明推测，由于改良后的ctab法减少了溶液a的抽提次数和dna沉淀的洗涤次数，减少了dna的损失，从而提高了dna的得率。并且从样品提取所用时间比较结果来看，本发明的耗时远低于传统的ctab法，因此在同等的时间内，利用本发明的方法处理的样本量远多于传统的ctab法。实施例6玉米叶片基因组dna的提取采用本发明的方法对玉米叶片基因组dna进行提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。实施例7小麦叶片基因组dna的提取采用本发明的方法对小麦叶片基因组dna进行提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。实施例8大豆叶片基因组dna的提取采用本发明的方法对大豆叶片基因组dna进行提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。实施例9水稻叶片基因组dna的提取采用本发明的方法对水稻叶片基因组dna进行提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。实施例10烟草叶片基因组dna的提取采用本发明的方法对烟草叶片基因组dna进行提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。如图5可知，通过本发明的改良ctab法提取玉米、小麦、大豆、水稻、烟草的基因组dna，电泳结果证明，其获得的基因组dna条带清晰完整，rna去除的也很干净，dna获得质量高。因此证明，本发明不光适用于富含多糖多酚的陆地棉基因组dna的提取，在别的农作物基因组dna提取中同样效果良好。并且，本发明相较于现有的ctab法，步骤简单耗时短，提取高效，能够大大降低科研人员的劳动强度。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12