本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够进行自我更新、多分化潜能的多能干细胞，可以向神经细胞、心肌细胞、肌细胞等多种终末组织器官的细胞分化，其在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。
研究显示，胎盘组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大将低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因使得胎盘间充质干细胞成为研究的热点。
但是，胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份胎盘组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将胎盘组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，本领域需要一个简单和高效的胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法。
本发明第一方面提出一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)通过PBS缓冲液清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；
(2)使用组织剪剪下步骤(1)得到的胎盘组织的胎盘小叶，然后使用粉粹机将胎盘小叶粉粹成小块组织；
(3)将步骤(2)获得的小块组织，按照1:1体积比加入预冷保护剂，混合均匀，分装至多个冻存管中，所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基的混合液；
(4)将步骤(3)获得的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时，-20℃冷藏2小时，-80℃下冷冻1天，最后在-196℃液氮中冷冻备用；
(5)需要时将步骤(4)冷冻的组织块从液氮中取出，在恒温水浴中解冻，用移液管吸取解冻的组织块，放入洁净的离心管中，加入PBS缓冲液混匀，然后离心，去掉上清液；
(6)在步骤(5)清洗后的组织块中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心，去掉上清液；
(7)使用间充质干细胞培养基重悬步骤(6)获得的细胞沉淀，放入预先置有间充质干细胞培养基的培养瓶中，置于CO2培养箱内培养；以及
(8)在培养后的3-4天进行第一次换液，以后3-4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代，即获得胎盘间充质干细胞。
根据本发明的一个实施例，所述胎盘小叶大小为5cm×5cm；所述小块组织大小为3mm×3mm。
根据本发明的一个实施例，所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基按照体积比为1:9进行混合而成。
根据本发明的一个实施例，所述玻璃化溶液含有体积分数27-32％甘油、12-16％乙二醇、12-16％二甲基亚砜和质量分数0.3-0.5M蔗糖。
根据本发明的一个实施例，所述玻璃化溶液含有体积分数30％甘油、15％乙二醇、15％二甲基亚砜和质量分数0.4M蔗糖。
根据本发明的一个实施例，步骤(6)所述消化的时间为20-30分钟。
根据本发明的一个实施例，所述间充质干细胞培养基含有：12-18重量份的FBS、0.8-1重量份的L-谷氨酰胺、0.02-0.05重量份的庆大霉素和80-90重量份的DMEM-F12。
根据本发明的一个实施例，所述间充质干细胞培养基含有：15重量份的FBS、1重量份的L-谷氨酰胺、0.04重量份的庆大霉素和85重量份的DMEM-F12。
根据本发明的一个实施例，本发明胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法进一步包括步骤：
(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；或
(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。
本发明另一方面，提出一种建立胎盘干细胞数据库的方法，该方法包括本发明第一方面所述方法的步骤，以及以下步骤：将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。
本发明操作简单，方便实用，能有效保护冻存的胎盘组织，避免复苏过程中细胞存活率流失，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有良好的细胞分化能力。本发明运用自胎盘中分离获得的大量纯度较高的间充质干细胞来建立胎盘干细胞库，以便储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。
附图说明
图1显示了根据本发明的一个实施例，解冻复苏后P1代细胞生长状态。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本申请作进一步详细说明。
实施例1
(1)取一名健康产妇正常分娩后的胎盘组织，离体后立即置于4℃的0.9％生理盐水中保存。用止血钳和组织剪将胎盘的胎膜和基蜕膜剥离，用PBS缓冲液清洗，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块。
(2)使用组织剪将步骤(1)得到的胎盘组织剪成5cm×5cm大小的胎盘小叶，然后使用粉粹机将胎盘小叶粉粹成大约3mm×3mm大小的组织块。
(3)将步骤(2)获得的组织块，按照1:1体积比加入预冷保护剂，混合均匀，分装至多个冻存管中。
(4)将步骤(3)获得的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时，-20℃冷藏2小时，-80℃下冷冻1天，最后在-196℃液氮中冷冻备用；
(5)需要时将步骤(4)冷冻的组织块从液氮中取出，在恒温水浴中解冻，用移液管吸取解冻的组织块，放入洁净的离心管中，加入PBS缓冲液混匀，然后2500rpm离心5分钟，去掉上清液；重复清洗两次。
(6)在步骤(5)清洗后的组织块中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，分别消化30分钟，然后使用200目筛网过滤收集消化后的细胞溶液，收集滤液，然后1200rmp离心10分钟，去掉上清液。
(7)使用间充质干细胞培养基重悬步骤(6)获得的细胞沉淀，放入预先置有间充质干细胞培养基的培养瓶中，置于5％CO237℃培养箱内培养。
(8)在培养后的3-4天进行第一次换液，以后3-4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用0.25％胰蛋白酶37℃消化2分钟，加入4-5倍体积的培养基终止消化反应，然后1200rpm离心10分钟，弃上清。沉淀用培养基重悬，以1:3比例传代，即获得胎盘间充质干细胞。
图1显示了P1代细胞生长状态。结果表明解冻后组织块在培养瓶内直接接种贴壁存活率高达95％，细胞生长良好。
所用试剂配方如下：
玻璃化溶液：体积分数为30％甘油、15％乙二醇、15％二甲基亚砜和质量分数为0.4M蔗糖。
间充质干细胞培养基：15重量份的FBS、1重量份的L-谷氨酰胺、0.04重量份的庆大霉素和85重量份的DMEM-F12。
保护剂：玻璃化溶液与间充质干细胞培养基按照体积比为1:9进行混合而成。
实施例2
针对实施例1传代后所得胎盘间充质干细胞，检测其细胞活性，以及细胞污染情况。
结果显示，细胞活性良好，无细胞污染情况。
实施例3
针对实施例1传代后所得胎盘间充质干细胞，参考实施例1步骤(4)与步骤(5)的方法，将胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。