本发明属于中药活性成分提取生产工艺领域，具体涉及响应面分析优化复合酶法提取肾茶多糖的最佳提取工艺条件。
背景技术：
植物多糖是天然药物的重要组成部分，大量研究表明，植物多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、免疫调节、护肝等功效，且细胞毒性极低。迄今，已有300多种多糖类化合物从天然产物中提取出来，其中从中药材中提得的水溶性多糖最为重要。目前，多糖提取的主要方法有水煎煮法、酸提取法、碱提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法等，这些提取方法都存一定的缺陷，如提取率不高，所含杂质较多，后续处理工序繁琐，或提取温度高，引起多糖分子结构变化、降解从而破坏多糖生物活性。此外，仪器设备成本高，不利于大规模工业化生产。植物成分往往被包裹在细胞壁内，要使细胞内的有效成分向提取液中扩散，必须破坏植物细胞壁，用一般的有机溶剂提取，细胞壁难以破坏，而酶法提取，提取条件温和，提取设备简单，提取效率高，可利用相应酶有效地破坏植物细胞壁，去除蛋白质，使细胞中的多糖更好地溶解出来，从而提高多糖得率。目前，多糖提取工艺多为均匀设计和正交设计，这些设计是采用固定其他因素，只改变一个因素的单因素考察法，不考虑因素之间的相互作用，难以考察多个响应值与因素之间的交互关系，只能对一个个孤立的因素进行分析，精确度不高。响应面分析法是一种最优化方法，它是将体系的响应作为一个或多个因素函数，考察各因素之间的相互作用，并借助软件可以三维模拟推测出更直观更精确的最佳工艺条件，并给出预测值。肾茶为唇形科(Lamiaceae)肾茶属(Clerodendranthus)植物肾茶[Clerodendranthus spicatus(Thunb.)C.Y.Wu]的干燥全草。肾茶作为一传统中草药可用于治疗急、慢性肾炎，膀胱炎，尿路结石等症，具有抑制肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖等作用。肾茶的多种功效与所含的肾茶多糖密不可分。为提高肾茶多糖的提取率，找出提取最佳工艺条件，本发明提供了响应面分析优化复合酶法提取肾茶多糖的工艺，复合酶法提取肾茶多糖，工艺简便，提取率高；提取工艺采用响应面分析设计，所得最佳工艺参数精确、可靠，为肾茶多糖的工业化生产和应用提供了确实可行的方法，对肾茶的综合开发利用及附加值的提高具有实际意义。
技术实现要素：
本发明采用复合酶法提取肾茶多糖，并采用响应面设计确定最佳提取工艺条件，纤维素酶能更充分地破坏植物细胞壁，使肾茶多糖更易于扩散到提取液中，同时木瓜蛋白酶能更有效地分解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来，二者的结合最大限度地提高了多糖的得率，制备出含量相对稳定的肾茶多糖。
本发明所采用的方法为复合酶法从肾茶中提取肾茶多糖的工艺方法。
本发明所采用复合酶法提取肾茶多糖的方法为：在预处理后的肾茶粉末中加入复合酶进行浸提，灭活酶、脱色素、浓缩、醇沉、脱蛋白等步骤，具体要求为，在料液比1:70，pH为4的料液中加入4～10％复合酶，于55℃浸提取2h，浸提一次，灭活酶、活性碳脱色两次、醇沉两次，sevag法除蛋白两次，蒽酮-硫酸法测定多糖含量和提取率。工艺分为：原料预处理、添加复合酶浸提、灭活酶、脱色素、浓缩、醇沉、除蛋白、醇沉等步骤，具体按以下步骤操作：
(1)原料预处理：将干燥后的肾茶粉碎，过40目筛，加入30倍体积80％乙醇，45℃加热浸提，除去肾茶中的脂类、单糖、双糖、低聚糖等成分，减压过滤，晾干回收肾茶粉末；
(2)添加复合酶热水浸提：将预处理后的肾茶粉末按1:70料液比加入用磷酸缓冲液调节至pH值为4的水溶液作提取液，加入肾茶重量4～10％的纤维素酶与木瓜蛋白酶组合，混匀，55℃水浴搅拌加热浸提2h，然后置于沸水浴中灭活酶10min，减压过滤得滤液；
(3)脱色素：在滤液中按生药量计加入1％活性碳，混匀，于55℃加热搅拌30min，过滤，取所得滤液，再重复上述操作进行第二次脱色，得脱色素肾茶粗多糖溶液；
(4)浓缩：将脱色素肾茶粗多糖溶液真空浓缩至浓度为含生药约为0.5g/mL，放至室温；
(5)第一次醇沉：在上述制备的浓缩液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，得醇沉肾茶粗多糖；
(6)除蛋白：将醇沉肾茶粗多糖用适量水溶解，加入其0.5倍体积的sevag试剂(三氯甲烷与正丁醇体积比为5:1)充分震荡，静置30min，4000rmp离心10min，取上清液，再重复上述操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；
(7)第二次醇沉：在脱蛋白的肾茶多糖溶液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，所得多糖用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得精制肾茶多糖。采用蒽酮-硫酸法测多糖含量，并计算多糖提取率。
本发明采用了响应面分析优化设计的方法对肾多糖的提取工艺进行了优化设计。
(1)各单因素对肾茶多糖提取的影响：
1)复合酶酶配比对多糖提取率及含量的影响：纤维素酶与木瓜蛋白酶不同配比对肾茶多糖提取率的影响见表1。从表1可知，纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为3:1时，所得多糖最高，这表明纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为3:1时，利于纤维素酶能更充分地破坏植物细胞壁，使肾茶多糖更易于扩散到提取液中，同时木瓜蛋白酶能更有效地分解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来，二者的结合最大限度地提高了多糖的得率。
表1复合酶酶配比对肾茶多糖提取率和含量的影响
2)料液比对多糖提取率及含量的影响：肾茶与提取液不同重量比对多糖提取率的影响见表2。从表2看出，随着料液比逐渐增大，多糖溶出率增大，当料液比为1:70时，多糖提取率达到最大，当溶液量过大时，肾茶粉末中的其他杂质会竞争性地参与溶出，使多糖提取率有所下降，表明，料液比为1:70利于肾茶多糖的提取。
表2料液比对多糖提取率及含量的影响
3)复合酶用量对多糖提取率及含量的影响：复合酶用量对多糖提取率及含量的影响见表3。从表3可看出，随着复合酶用量的增大，多糖的提取率也增大，当复合酶用量达8％时，多糖提取率达到最大，之后随着复合酶用量增大，多糖提取率反而降低。
表3复合酶用量对多糖提取率及含量的影响
4)提取温度对多糖提取率及含量的影响：提取温度对多糖提取率及含量的影响见表4。由表4可看出，在35～55℃范围随着提取温度的升高，多糖提取率增大，当温度为55℃时，多糖提取率最高，之后随着温度升高，提取率降低，表明在复合酶最在55℃附近时最有利发挥复合酶效应。
表4提取温度对多糖提取率及含量的影响
5)提取液的pH值对多糖提取率及含量的影响：提取液的pH值对多糖提取率及含量的影响见表5。由表5可看出，提取液pH值为4时，肾茶酶解效率最佳，多糖提取率最高，表明纤维素酶与木瓜蛋白酶在酸性条件下，酶活力较强，从而促进多糖的提取。
表5提取液的pH值对多糖提取率及含量的影响
6)：提取时间对多糖提取率及含量的影响见表6。由表6可看出，随着提取时间的延长，多糖提取率逐渐增高，当提取3h时，多糖提取率最高，随着提取时间增加，复合酶逐渐失活，多糖得率降低，所以多糖提取最佳时间为3h。
表6提取时间对多糖提取率及含量的影响
(2)利用响应面分析优化设计提取方案
根据响应面设计要求，统计模型发现复合酶用量、提取温度、提取时间及提取pH四个响应因素对肾茶多糖提取率和含量有显著影响。因此可在单因素的基础上进行四因素三水平的响应面分析优化设计。试验因素及水平如下表7。
表7因素与水平编码表
(3)复合酶响应面提取肾茶多糖试验结果及显著性分析
根据Design-expert.V8.0.6软件中的Box-Benhnken实验设计原理，以肾茶多糖提取率为响应值，设计了以复合酶用量(A)、提取温度(B)、提取时间(C)及提取pH(D)四因素三水平的响应面分析实验，得到了响应面优化复合酶法提取肾茶多糖的试验结果见表8。
表8响应面优化复合酶法提取肾茶多糖的试验结果
(4)复合酶应面优化提取肾茶多糖模型显著性分析
复合酶应面优化提取肾茶多糖模型显著性分析结果见表9。
表9复合酶应面优化提取肾茶多糖模型显著性分析
注：*P<0.05差异显著；**P<0.01差异极显著。
由响应面分析结果得知，肾茶多糖提取率与复合酶用量、提取pH、提取温度、提取时间都有显著的影响，其中提取温度影响最突出，依次是提取pH、复合酶用量、最后是提取时间。由响应面三维图得肾茶多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度56.65℃、提取pH4.11、复合酶用量8.44％、提取时间3.05h，在此条件下肾茶多糖的提取率为15.75％。
本发明的有益效果是：本发明所采用的复合酶提取工艺，较传统高温水煮或单酶提取工艺的多糖得率高，按肾茶与提取液重量1:70加入去离子水，100℃浸提3h，多糖提取率为8.96％；按料液比1:70，pH为4，4％酶纤维素酶于55℃浸提取3h，多糖提取率为10.01％。酶法是一种温和的方法，提取条件温和，避免多糖结构的破坏，增加多糖得率。纤维素酶能更充分地破坏植物细胞壁，使肾茶多糖更易于扩散到提取液中，同时木瓜蛋白酶能更有效地分解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来，纤维素酶与木瓜蛋白酶以3:1重量比组合而成的复合酶最大限度地提高了多糖的得率。本发明可以大规模用于工业化生产，是获得生物活性多糖的高效方法。采用响应面分析优化得到的提取条件参数准确可靠，具有一定的市场应用与生产前景和相应的社会经济效益。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的复合酶法提取肾茶多糖的方法包括以下步骤：
S101：原料预处理：将干燥后的肾茶粉碎，过40目筛，加入30倍体积80％乙醇，45℃加热浸提，除去肾茶中的脂类、单糖、双糖、低聚糖，减压过滤，晾干回收肾茶粉末；
S102：热水浸提：将预处理后的肾茶粉末按1:70料液比加入用磷酸缓冲液调节至pH值为4的水溶液作提取液，加入肾茶重量4～10％酶配比为3:1纤维素酶与木瓜蛋白酶组合，混匀，55℃水浴搅拌加热浸提2h，然后置于沸水浴中灭活酶10min，减压过滤得滤液；
S103：脱色素：在滤液中按生药量计加入1％活性碳，混匀，于55℃加热搅拌30min，过滤，取所得滤液，再重复上述操作进行第二次脱色，得脱色素肾茶粗多糖溶液；
S104：浓缩：将脱色素肾茶粗多糖溶液真空浓缩至浓度为含生药约为0.5g/mL，放至室温；
S105：第一次醇沉：在溶液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，得醇沉肾茶粗多糖；
S106：除蛋白：将醇沉肾茶粗多糖用适量水溶解，加入其0.5倍体积的sevag试剂充分震荡，静置30min，4000rmp离心10min，取上清液，再重复上述操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；
S107：第二次醇沉：在脱蛋白的肾茶多糖溶液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，所得多糖用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得精制肾茶多糖。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
(1)原料预处理：将干燥后的肾茶粉碎，过40目筛，加入30倍体积80％乙醇，45℃加热浸提，除去肾茶中的脂类、单糖、双糖、低聚糖等成分，减压过滤，晾干回收肾茶粉末；
(2)热水浸提：将预处理后的肾茶粉末按1:70料液比加入用磷酸缓冲液调节至pH值为4的水溶液作提取液，加入肾茶重量4～10％纤维素酶与木瓜蛋白酶组合，混匀，55℃水浴搅拌加热浸提2h，然后置于沸水浴中灭活酶10min，减压过滤得滤液；
(3)脱色素：在滤液中按生药量计加入1％活性碳，混匀，于55℃加热搅拌30min，过滤，取所得滤液，再重复上述操作进行第二次脱色，得脱色素肾茶粗多糖溶液；
(4)浓缩：将脱色素肾茶粗多糖溶液真空浓缩至相当于生药约为0.5g/mL，放至室温；
(5)第一次醇沉：在上述制备的浓缩液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，得醇沉肾茶粗多糖；
(6)除蛋白：将醇沉肾茶粗多糖用适量水溶解，加入其0.5倍体积的sevag试剂(三氯甲烷与正丁醇体积比为5:1)充分震荡，静置30min，4000rmp离心10min，取上清液，再重复上述操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；
(7)第二次醇沉：在脱蛋白的肾茶多糖溶液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得精制肾茶多糖。
(8)肾茶多糖含量的测定：采用蒽酮-硫酸法测多糖含量，并计算多糖提取率。
本发明采用了响应面图像分析所得的最佳提取条件：提取温度56.65℃、提取pH4.11、复合酶用量8.44％、提取时间3.05h，考虑实验的易操作性，将工艺条件修正为：提取温度57℃、提取pH4、复合酶用量8.4％、提取时间3h，进行3次提取，结果见表10，肾茶多糖的提取率分别为15.38、15.42％、15.31％。修正后的工艺条件下进行的3次平行实验所得的肾茶多糖提取率的平均值为15.37％，与理论预测值的相对误差为2.41％。
表10复合酶响应面优化提取肾茶多糖具体实施结果
实施例2
(1)原料预处理：将干燥后的肾茶粉碎，过40目筛，加入30倍体积80％乙醇，混合均匀，45℃加热浸提，除去肾茶中的脂类、单糖、双糖、低聚糖等成分，减压过滤，晾干回收肾茶粉末；
(2)热水浸提：称取预处理后的肾茶粉末10g，加入700mL用磷酸缓冲液调节至pH值为4的水溶液作提取液，添加8.4％纤维素酶与木瓜蛋白酶酶配比为3:1的复合酶，混合均匀，57℃水浴搅拌加热浸提3h，然后置于沸水浴中灭活酶10min，减压过滤得滤液；
(3)脱色素：在滤液中加入0.1g活性碳，混匀，于55℃加热搅拌30min，过滤，取所得滤液，再重复上述操作进行第二次脱色，得脱色素肾茶粗多糖溶液；
(4)浓缩：将脱色素肾茶粗多糖溶液真空浓缩约至20mL，放至室温；
(5)第一次醇沉：在上述制备的浓缩液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，得醇沉肾茶粗多糖；
(6)除蛋白：将上述醇沉所得的肾茶粗多糖加约20mL去离子水溶解，加入10mL左右sevag试剂(三氯甲烷与正丁醇体积比为5:1)充分震荡，静置30min，4000rmp离心10min，取上清液，再重复上述操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；
(7)第二次醇沉：在脱蛋白的肾茶多糖溶液中加入95％乙醇至含醇量约为80％，密封，静置24h，减压过滤，所得多糖用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得精制肾茶多糖1.531～1.542g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。