降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法与流程

本申请要求于2016年12月29日向韩国专利局提出的韩国专利申请第2016-0182955号的优先权，该韩国专利申请的全部内容在此引入本申请作为参考。【
技术领域：
】本发明涉及降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法。
背景技术：
：核酸扩增作为在分子生物学上用于广泛的方法的必要的过程，被提出多种扩增方法。例如，在miller，h.i.等(wo89/06700)中揭示了包括将启动子/引物序列与靶单链dna(“ssdna”)杂交后对上述序列的大量rna复制进行转录的过程的核酸序列扩增方法。其他公知的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(kwoh，d.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.，86:1173(1989)；以及gingerast.r.etal.，wo88/10315)。公知为聚合酶链式反应(以下，称为“pcr”)的最常用的核酸扩增方法包括双链dna的变性、利用dna模板的低聚核苷酸引物退火及基于dna聚合酶的引物延伸的反复的循环过程(mullis等，美国专利第4683195号、第4683202号及第4800159号；saiki等，(1985)science230，1350-1354)。基于pcr的技术不仅利用于靶dna序列的扩增，而且还广泛利用于生物学及医学研究领域中的科学应用或方法，例如，逆转录酶pcr(rt-pcr)、差别显示pcr(dd-pcr)、基于pcr的公知或未知的基因的克隆、cdna末端的快速扩增(race)、随机引物pcr(ap-pcr)、多重pcr、snp基因组分型及基于pcr的基因组分析(mcphersonandmoller，2000)pcr.biosscientificpublishers，springer-verlagnewyorkberlinheidelberg，ny)。上述基于pcr的技术伴随着靶核酸分子的扩增，因此，仅要求准确且有效地扩增靶序列。为此，需要通过选择合适的序列及长度的引物并适当调节所使用的成分(例如，dna聚合酶、dntps、mg离子及缓冲液)的类型、含量及反应温度/时间来进行扩增反应。但是，在某些情况下，难以选择最佳的反应条件，而且在所选择的反应条件下也不能达到感到满意的扩增效率。为了更有效的扩增而开发了多种方法。另一方面，由于引物二聚体的形成而导致扩增效率的降低。关于此，在lebedevatal中揭示了如下的方法，即，为了防止在初期反应中在低温条件下产生的引物的非特异性杂交，在引物的3’末端磷酸二酯键或第二个磷酸二酯键使用导入有4-氧代-1-戊基(oxp)磷酸三酯(pte)基的引物来改善特异性及扩增效率(参照：lebedevatal.，nucleicacidsres2008；36:e131)。引物通过与靶分子特异性杂交来开始进行扩增，因此对扩增反应的特异度及效率产生显著的影像。尤其，在使用多个引物的多重扩增反应中，更加强调引物的重要性。代表性地，为了最小化引物二聚体形成而使用变更与引物杂交的部位或调节引物的序列或长度的方法，但是适用于在多重扩增反应中所使用的引物设计中是有限的。因此，仍然需要有效抑制引物二聚体形成的新的方法，这种方法将会单独或通过与如上所述的公知的方法组合而以更经济且更简单的方式改善扩增效率。在本申请中，参照了多篇专利及引用文献并提供在括号内。这些专利及引用文献的揭示内容为了更详细地描述本发明及本发明所属的
技术领域：
而全部内容在此引入本申请作为参考。技术实现要素：【技术问题】本发明人为了在多重扩增反应中，尤其在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中可有效降低引物二聚体形成的方法而努力。其结果，本发明人发现，若在多重扩增反应中使用含有(多个)通用碱基核苷酸的(多个)引物，则抑制引物二聚体形成，从而可以提高扩增效率。因此，本发明的目的在于，提供通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法。本发明的再一目的在于，提供在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中降低引物二聚体形成的方法。本发明的另一目的在于，提供用于在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的试剂盒。本发明的还有一目的在于，提供包括为了使用通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法而使处理器设计引物对的指令的计算机可读存储介质。本发明的目的及优点通过结合所附的保护范围及附图和下述的说明而变得更加明确。【解决问题的手段】根据本发明的第一实施方式，本发明提供在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法，包括：包括步骤(a)，制备分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对，上述每个引物对包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，上述至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物(通用碱基引物)，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围内，使用上述至少三个引物对的多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；步骤(b)，使用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应，上述多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。本发明人为了在多重扩增反应中，尤其在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中可有效降低引物二聚体形成的方法而努力。其结果，本发明人发现，若在多重扩增反应中使用含有(多个)通用碱基核苷酸的(多个)引物，则抑制引物二聚体形成，从而可以提高扩增效率。在以往的核酸扩增反应中，可通过引物之间的杂交来偶然生成如引物二聚体的非特异性副产物。本发明涉及抑制非特异性副产物中的引物二聚体。本文中所使用的术语“引物二聚体(primerdimer)”是指两个引物通过相互杂交(inter-hybridization)或者单引物通过自杂交(intra-hybridization；self-hybridization)来形成的杂交物(hybrid)。尤其，引物二聚体包含通过与相同或不同的靶核酸分子杂交的引物对来形成的杂交物。并且，本文中所使用的引物二聚体不仅包含两个引物的杂交物自身，而且还包含组成杂交物的一个或两个引物链延伸的延伸产物。可根据引物二聚体的每个引物链延伸与否来将引物二聚体分类为三种：(i)不可延伸的引物二聚体；(ii)一条链可延伸的引物二聚体；以及(iii)两条链可延伸的引物二聚体(参照图2)。本文中所使用的不可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链不被核酸聚合酶延伸的引物二聚体(参照图2的上部列)。本文中所使用的一条链可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链中的一个被核酸聚合酶延伸的引物二聚体(参照图2的中间列)。两条链可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链被核酸聚合酶延伸的引物二聚体(参照图2的下部列)。根据本发明人所进行的实验，不可延伸的引物二聚体或一条链可延伸的引物二聚体的形成对靶核酸分子的扩增产生的影响并不明显，与此相反，两条链可延伸的引物二聚体的形成在核酸扩增反应中妨碍引物与靶核酸分子的杂交。并且，两条链可延伸的引物二聚体的扩增导致在靶核酸扩增反应中需要使用的酶、dntp等的浪费，并对于与引物之间的结合增加与靶核酸分子竞争的非特异性扩增产物，从而会恶化正常的核酸扩增反应的效率。因此，本发明的目的在于，通过抑制两条链可延伸的引物二聚体不必要的形成及扩增来改善靶扩增效率。以下，将本发明的方法按各步骤进行详细说明。【步骤(a)：至少三个引物对的制备】根据本发明，首先确定需要扩增的至少三个靶核酸分子。本发明的方法可适用于多种多重扩增反应，但是，本发明的方法的特征及优点可在与至少三个靶核酸分子有关的扩增反应中会更加明确。本文中所使用的术语“靶核酸分子”、“靶分子”或“靶核酸”是指最终扩增或检测的核酸分子。本文中所使用的“靶核酸分子”或“核酸分子”可分别与“靶核酸序列”或“核酸序列”互换使用。靶核酸分子不仅包含双链，而且还包含单链。靶核酸分子不仅包含在试样中最初存在的核酸序列，而且还包含在反应中新生成的核酸序列。靶核酸分子可包含任意dna(gdna及cdna)、rna分子及它们的杂交物(嵌合核酸)。上述分子可为双链形态或单链形态。在作为起始物质的核酸为双链的情况下，优选地，将双链制成单链或部分单链形态。分离链的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶促方法(例如，解螺旋酶作用)及结合蛋白，但并不限定于此。例如，链分离可通过在80～105℃的温度下进行加热来实现。用于实现这种处理的普通方法由josephsambrook，等，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2001)提供。靶核酸序列包含任意自然产生原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包括哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、hiv、流感病毒、eb病毒、肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。靶核酸分子还可以为通过重组生成或可能会生成或者化学合成或可能会化学合成的任意核酸分子。因此，核酸序列可在自然界中被发现或不被发现。靶核酸分子不应解释为限制在给出的时间点公知的序列或在给出的时间点可利用的序列，但应解释为包括可在当前或未来的任意时间点利用或公知的序列。即，靶核酸分子可在实施本发明的方法的时间点公知或未公知。未公知的靶核酸的序列可在实施本发明的方法之前由以往的排序方法中的一种确定。在靶分子为靶核酸分子的情况下，样品可经过本领域公知的核酸提取过程(参照：sambrook，j.etal.，molecularcloning，alaboratorymanual，3rded.coldspringharborpress(2001))。核酸提取过程可根据样品的类型而不同。并且，在所提取的核酸为rna的情况下，可额外实施用于合成cdna的逆转录过程(参照：sambrook，j.etal.，molecularcloning，alaboratorymanual，3rded.coldspringharborpress(2001))根据本发明的一实例，靶核酸序列包括核苷酸变异。本文中所使用的术语“核苷酸变异(nucleotidevariation)”是指序列相似的连续性dna段中的特定位置的dna序列内的一个或多个核苷酸取代、缺失或插入。这种连续性dna段包含一个基因或染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异包括变异或多态等位基因变异。例如，在本发明检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态(snp，singlenucleotidepolymorphism)、变异、缺失、插入、取代及易位。例示性核苷酸变异包括人类基因组内的多种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr，methylenetetrahydrofolatereductase)基因的变异)、与病原体的耐药性相关的变异及与发生癌症相关的变异。本文中所使用的术语“核苷酸变异”包括在核酸序列内的特定位置中的自然型及其任意变异型。本文中所使用的表述“确定需要扩增的至少三个靶核酸分子”是指确定需要扩增何种核酸序列的过程，即，从多个核酸分子中选择需要扩增的至少三个靶核酸分子的过程。在本发明的一实例中，需要扩增的靶核酸分子为至少三个靶核酸分子、至少四个靶核酸分子、至少五个靶核酸分子、至少六个靶核酸分子、至少七个靶核酸分子或至少八个靶核酸分子。例如，需要扩增的靶核酸分子为3～20个、3～18个、3～15个、3～12个、3～10个、3～8个、3～5个、4～20个、4～18个、4～15个、4～12个、4～10个、4～8个、4～5个、5～20个、5～18个、5～15个、5～12个、5～10个或5～8个靶核酸分子。在本发明的一实例中，至少三个引物对、至少四个引物对、至少五个引物对、至少六个引物对、至少七个引物对或至少八个引物对分别使用于至少三个靶核酸分子、至少四个靶核酸分子、至少五个靶核酸分子、至少六个靶核酸分子、至少七个靶核酸分子或至少八个靶核酸分子的扩增。根据一实例，通过本发明的方法扩增或检测的靶核酸分子的数量与本发明的方法中所使用的引物对的数量相同。根据本发明，为了扩增至少三个靶核酸分子而制备至少三个引物对，每个引物对包含正向引物及反向引物。每个引物包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少三个引物对为三个引物对、四个引物对、五个引物对等。本文中所使用的术语“引物”是指在与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件，即，在存在如核苷酸何dna聚合酶的聚合剂的条件下当处于适合的温度和ph时可起开始点作用的低聚核苷酸。优选地，引物为单链的脱氧核糖核苷酸。本发明中所使用的引物可包含自然产生(naturallyoccurring)dnmp(即，damp、dgmp、dcmp及dtmp)、变形核苷酸或非天然核苷酸。引物还可以包含核糖核苷酸。引物要足够长，以在存在聚合剂的条件下可引发延伸产物的合成。引物的适合的长度可根据如温度、应用领域及引物的来源(source)等多种要素而不同。本文中所使用的术语“退火”或“引发”是指使低聚核苷酸或核酸同位(apposition)在模板核酸，通过上述同位使聚合酶聚合核苷酸来形成与模板核酸或其一部分互补的核酸分子。术语“互补”是指足以在规定的退火或杂交条件下引物或探针选择性地与靶核酸序列杂交的互补，包括术语“实质上互补(substantiallycomplementary)”及“完全互补(perfectlycomplementary)”，优选地，包括完全互补。本文中所使用的术语“杂交”是指从互补的单链的核酸形成双链的核酸。杂交可在完全匹配或者一部分被错配的实质上匹配的两个核酸链之间产生。用于杂交的互补性可根据杂交条件，尤其是温度而不同。术语“退火”和“杂交”没有区别，两种术语可互换使用。本文中所使用的术语“引物对(primerpair)”、“引物对(pairofprimers)”、“一个引物对”及“一种引物对”包含正向引物对和反向引物对。引物对可使用于与一个靶核酸分子有关的扩增反应。并且，如本文中所提到的多个引物对，例如，(至少)两个引物对、(至少)三个引物对、(至少)四个引物对等是指引物对的数量为多个且引物对互不相同。因此，如本文中所使用的术语“至少三个引物对”是指引物对的数量至少为3个且引物对互不相同。表述“引物对互不相同”可包括(i)引物对相互实质上不同或者(ii)引物对相互完全不同的意思。表述“引物对相互实质上不同”是指一个引物对的正向引物与其他引物对的正向引物不同或者一个引物对的反向引物与其他引物对的反向引物不同。表述“引物对相互完全不同”是指一个引物对的正向引物与其他引物对的正向引物不同且一个引物对的反向引物与其他引物对的反向引物不同。本发明的方法通常使用相互完全不同的至少三个引物对，但是不排除使用相互实质上不同的至少三个引物对。根据一实例，本发明的引物对相互完全不同。两个不同的引物对可用“两个引物对”表示，三个不同的引物对可用“三个引物对”表示。并且，表述“引物互不相同”是指引物的长度不同或者不以一个序列表示引物或不以在内部包含五个以下的多义碱基的一个序列表示引物。例如，在为了在保守区域内具有部分变异的核酸而以在特定部位包含多义碱基的方式设计引物的情况下，将上述引物考虑为相同的引物，即，单引物，这是因为将它们表示为具有相同长度的序列且包含五个以下的多义碱基的一个序列。根据本发明的一实例，术语“单引物或一个引物”为具有特定长度且由一个序列表示或由包含五个以下，尤其四个以下，更尤其三个以下的多义碱基的序列表示的引物。本文中使用与核酸碱基有关的iub简并码。在此码中，r是指嘌呤碱基a或g，y是指嘧啶碱基c或t，m是指氨基碱基a或c，k是指酮碱基g或t，s是指更强的氢键配偶体c或g，w是指更弱的氢键配偶体a或t，h是指a、t或c，b是指g、t或c，d是指g、a或t，v是指g、a或c，n是指a、c、g或t。在本发明中，在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中所使用的分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对包含多个引物。一般而言，引物的总数为引物对的总数的两倍。但是，在引物对之间存在一个以上的相同的引物的情况下，引物的总数可小于引物对的总数的两倍。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少三个引物对包含4、5或6个引物。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少五个引物对包含6、7、8、9或10个引物。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少七个引物对包含8、9、10、11、12、13或14个引物。一般而言，如脱氧肌苷或肌苷的通用碱基由于其分别与四个标准核苷酸碱基无差别性地配对的能力而作为“多义碱基”被广泛利用。尤其，含有肌苷的引物补偿靶密码子的高比率多义性，且可实质上减少整个引物的多义性、错误的引发及非靶基因扩增(kilpatrick，d.r.etal.，1996.j.clin.microbiol.34:2990-2996；rossolini.g.m.etal.，1994.mol.cell.probes8:91-98)。但是，在本发明中，并没有尝试将如肌苷的(多个)通用碱基包含在引物的核心区域来抑制在多重扩增反应中形成二聚体。本发明的方法利用包含(多个)通用碱基核苷酸的引物来减少引物二聚体，尤其，两条链可延伸的引物二聚体的形成并改善靶扩增效率。根据本发明，可通过将通用碱基核苷酸整齐地排列在引物内来维持以往的引物(即，包含与靶互补的自然产生碱基的引物，而不是包含通用碱基核苷酸的引物)的特性(例如，与互补性序列的特异性结合及基于聚合酶的延伸)并有效抑制引物二聚体的形成。将按照本发明中所提出的策略制备的引物称为通用碱基引物(universalbaseprimer：ubp)。本文中所使用的术语“通用碱基引物(universalbaseprimer：ubp)”是指引物内的至少一个核苷酸含有通用碱基的引物，而不是指含有自然产生碱基(a、c、g或t(u))的引物。在本发明中，通用碱基引物起与引物二聚体形成有关的抑制剂作用。尤其，将通用碱基中包含脱氧肌苷或肌苷的引物称为肌苷引物(inosineprimer；ipm)。相反，本文中所使用的术语“以往的引物”是指仅由自然产生核苷酸(a、c、g或t(u))组成的常用的引物。本文中所使用的引物可在内部合成或者通过用于合成引物的第三者来合成。根据本发明使(多个)通用碱基包含在引物内是为了在与至少三个引物对有关的多重扩增反应中抑制引物二聚体形成并提高扩增效率。在核酸扩增过程中，可通过引物的部分序列之间的杂交来形成引物二聚体。通用碱基与自然产生碱基之间的结合强度比两个互补的自然产生碱基之间的结合强度相对低，因此，可通过将至少一个通用碱基核苷酸包含在适合的位置，即，引物的核心区域来降低引物二聚体的tm并抑制引物二聚体的形成。根据本发明，通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸。在一实例中，通用碱基引物具有1～2个通用碱基核苷酸。术语“通用碱基核苷酸”是指包含通用碱基的核苷酸，而不是指包含自然产生碱基的核苷酸。上述术语可与“通用核苷酸”、“含有通用碱基的核苷酸”、“包含通用碱基的核苷酸”等互换使用。若在通用碱基引物内包含至少四个通用碱基，则由于通用碱基核苷酸的高比率而使靶与引物之间的杂交效率降低，因此不优选。因此，为了维持靶与引物之间的稳定的杂交，适合包含三个以下，尤其两个以下的通用碱基核苷酸。根据本发明，通用碱基引物具有1～3个通用碱基，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域。本文中所使用的术语“核心区域”是指为了抑制引物二聚体形成，尤其两条链可延伸的引物二聚体形成而使一个或两个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物内的最佳位置范围。即，核心区域是指为了使一个或两个通用碱基核苷酸发挥最大效果而使它们位于通用碱基引物内的特定区域。组成引物二聚体，尤其两条链可延伸的引物二聚体的两个引物链可在进行延伸反应的过程中被消耗而使用于靶核酸分子的扩增。本发明人发现通过使一个以上的通用碱基核苷酸位于一个或两个引物链的核心区域来最小化3’-末端部分参与两条链可延伸的引物二聚体的形成的可能性。根据本发明人所进行的实验结果可知，靶核酸分子的扩增受两条链可延伸的引物二聚体的形成带来的影响很大。两条链可延伸的引物二聚体通常通过两个引物链的3’-末端部分之间的杂交而生成，因此，优选地，通过使一个或两个通用碱基核苷酸位于3’-末端部分来抑制两条链可延伸的引物二聚体的形成。在本发明中，在通用碱基引物内的核心区域的准确的位置是在靶扩增及引物二聚体形成的方面上确定。即，通过确认不对靶核酸分子的扩增产生负面影响且在抑制引物二聚体的形成的过程中起重要作用的区域来确定通用碱基引物内的核心区域的准确的位置。根据本发明的方法，通用碱基引物内的核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸的范围。一般而言，位于引物的3’-末端的第一个核苷酸或第二个核苷酸对引物的延伸产生显著的影像。例如，在位于引物的3’-末端的第一个核苷酸或第二个核苷酸不与靶核酸分子的相应的核苷酸互补的情况下，位于引物的3’-末端的第一个核苷酸或第二个核苷酸不与靶核酸分子的相应的核苷酸杂交，上述3’-末端不延伸，由此最终可以大大降低靶扩增效率。类似地，在本发明的通用碱基引物的情况下，通过使通用碱基核苷酸位于在通用碱基引物的3’-末端中的第一个位置或第二个位置来降低位于3’-末端的第一个核苷酸或第二个核苷酸与靶核酸分子的相应的核苷酸之间的结合，从而降低靶扩增效率。因此，根据本发明的一实例，当从靶扩增效率方面考虑时，存在通用核苷酸的核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至其以上的核苷酸(例如，第四个、第五个、第六个、第七个以上的核苷酸)。另一方面，两条链可延伸的引物二聚体对靶扩增的效果根据引物二聚体内的互补(重叠)核苷酸的数量而不同。本发明人的所进行的实验结果表明，在内部含有四个互补核苷酸的引物二聚体(具有四个重叠核苷酸的引物二聚体)对靶扩增产生的影响并不明显，相反，在内部含有五个互补核苷酸的引物二聚体(具有五个重叠核苷酸的引物二聚体)可根据靶的类型而对靶扩增产生影响，在内部含有六个互补核苷酸的引物二聚体(具有六个重叠核苷酸的引物二聚体)对靶扩增产生显著影响。因此，为了作为对靶扩增产生很大影响的二聚体类型的在内部具有六个互补核苷酸的二聚体引物的形成，通用碱基核苷酸可位于第六个核苷酸以下。根据本发明，若使通用碱基核苷酸位于在通用碱基引物的3’-末端中的第一个核苷酸或第二个核苷酸，则可降低靶扩增效率，因此优选。相反，若使通用碱基核苷酸位于第三个核苷酸，则可抑制具有位于每个引物链的3’-末端的三个以上的互补核苷酸的引物二聚体的形成，若使通用碱基核苷酸位于第四个核苷酸，则可抑制具有位于每个引物链的3’-末端的四个以上的互补核苷酸的引物二聚体的形成，若使通用碱基核苷酸位于第五个核苷酸，则可抑制具有位于每个引物链的3’-末端的五个以上的互补核苷酸的引物二聚体的形成，若使通用碱基核苷酸位于第六个核苷酸，则可抑制具有位于每个引物链的3’-末端的六个以上的互补核苷酸的引物二聚体的形成。根据一实例，本发明可防止两个引物链的杂交，因此，可防止两条链可延伸的引物二聚体的形成。如上所述，需要注意的是，在内部具有四个以下的互补核苷酸的引物二聚体的形成对靶扩增效率产生的影响并不明显。若使通用碱基核苷酸位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸，则抑制含有位于每个引物链的3’-末端的两个互补核苷酸的引物二聚体的形成，但是，上述引物二聚体的形成不影响靶扩增效率。相反，具有以如上所述的方式存在的通用碱基核苷酸的通用碱基引物可抑制在内部具有三个以上的互补核苷酸的引物二聚体的形成，从而适合实现不发明的目的。根据本发明的一实例，核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸、第三个核苷酸至第五个核苷酸、第三个核苷酸至第四个核苷酸、第四个核苷酸至第六个核苷酸、第四个核苷酸至第五个核苷酸、第五个核苷酸至第六个核苷酸，尤其，在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第五个核苷酸的范围。关于核心区域的定义及通用碱基核苷酸的位置，位于引物的3’-末端的第一个核苷酸是指位于3’-末端的核苷酸，即，3’最终核苷酸(ultimate)核苷酸(3’-末端核苷酸)。依次地，在通用碱基引物的3’-末端中的第二个核苷酸是指位于倒数第二个位置的核苷酸，即，在3’末倒数第二个(penultimate)核苷酸，在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸是指位于倒数第三个位置的核苷酸，即，在3’末倒数第三个(antepenultimate)核苷酸，在通用碱基引物的3’-末端中的第四个核苷酸是指位于倒数第四个位置的核苷酸，即，在3’末倒数第四个(preantepenultimate)核苷酸，在通用碱基引物的3’-末端中的第五个核苷酸是指位于倒数第五个位置的核苷酸。上述位置的说明以相同的方式适用于引物的5’-末端。在一例中，若假设具有序列5’-agnnnnnnnnnnnnnct-3’(a：腺嘌呤，g：鸟嘌呤，n：任意核苷酸，c：胞嘧啶，t：胸腺嘧啶)的引物，则“a”相当于位于引物的5’-末端的第一个核苷酸，“g”相当于位于引物的5’-末端的第二个核苷酸，“c”相当于位于引物的3’-末端的第二个核苷酸，“t”相当于位于引物的3’-末端的第一个核苷酸。在另一例中，若假设具有序列5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggggaa-3’(a：腺嘌呤，g：鸟嘌呤)的引物，位于3’-末端的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域为“ggggg”。根据本发明，通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性。这意味着通用碱基引物内的通用碱基核苷酸不相邻。根据本发明，一个或两个通用碱基核苷酸可位于核心区域。根据本发明，表述“通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性”可与表述“通用碱基核苷酸在通用碱基引物以相隔开的方式存在”互换使用。本文中所使用的表述“通用碱基核苷酸在通用碱基引物以相隔开的方式存在”是指在两个通用碱基核苷酸之间存在其他(多个)核苷酸。例如，“通用碱基核苷酸在通用碱基引物中，两个核苷酸以相隔开的方式存在”是指在上述两个通用碱基核苷酸之间存在两个其他核苷酸。在本发明的一实例中，通用碱基核苷酸在通用碱基引物中，至少1、2、3、5、8、10、12、15及20个核苷酸以相隔开的方式存在。在本发明的一实例中，通用碱基核苷酸在通用碱基引物中，至少1～10个核苷酸以相隔开的方式存在，例如，在通用碱基引物中，1～8个核苷酸、1～6个核苷酸、1～4个核苷酸、2～10个核苷酸、2～8个核苷酸、2～6个核苷酸、2～4个核苷酸、3～10个核苷酸、3～8个核苷酸、3～6个核苷酸或3～4个核苷酸以相隔开的方式存在。根据本发明，在存在除了存在于核心区域的(多个)通用碱基核苷酸之外的其他(多个)通用碱基核苷酸的情况下，位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸范围的区域。当考虑到核心区域的界限会发生变化时，其余(其他(多个)通用碱基核苷酸)可位于除了核心区域、在通用碱基引物的5’-末端中的三个连续的核苷酸、在通用碱基引物的3’-末端中的两个连续的核苷酸之外的区域。即，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至与核心区域的5’最后核苷酸相邻的核苷酸(旁边的核苷酸)的范围的区域。不位于核心区域的其余(多个)通用碱基核苷酸的位置通过如下方式确定：(i)(多个)若使通用碱基核苷酸位于在通用碱基引物的3’-末端中的第一个核苷酸位置或第二个核苷酸位置，则妨碍靶扩增；(ii)若使(多个)通用碱基核苷酸位于在通用碱基引物的5’-末端中的第一个核苷酸位置(5’ultimatenucleotide)、第二个核苷酸位置(5’penultimatenucleotide)或第三个核苷酸位置(5’antepenultimatenucleotide)，则通过在上述位置上的杂交形成的引物二聚体因短的延伸而不对靶扩增产生很大的影像，因此，不足以改善靶扩增。综上所述，其余位于除了核心区域、在通用碱基引物的5’-末端中的三个连续的核苷酸、在通用碱基引物的3’-末端中的两个连续的核苷酸之外的区域。根据本发明，通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸范围的区域。根据一实例，通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第五个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第六个核苷酸范围的区域。根据通用碱基引物内的通用碱基的数量，对通用碱基引物内的1个至3个的通用碱基核苷酸的位置的描述如下：(i)在通用碱基引物具有一个通用碱基核苷酸的情况下，通用碱基位于核心区域。(ii)在通用碱基引物具有两个通用碱基核苷酸的情况下，在一实例中，两个通用碱基核苷酸位于核心区域。在代替性的实例中，一个通用碱基核苷酸位于核心区域，其他通用碱基核苷酸位于除了核心区域、在通用碱基引物的5’-末端中的三个连续的核苷酸及在通用碱基引物的3’-末端中的两个连续的核苷酸之外的区域。在核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸的范围的情况下，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围的区域，在核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第五个核苷酸的范围的情况下，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第六个核苷酸的范围的区域。(iii)在通用碱基引物具有三个通用碱基核苷酸的情况下，在一实例中，一个通用碱基核苷酸位于核心区域，两个通用碱基核苷酸位于除了核心区域、在通用碱基引物的5’-末端中的三个连续的核苷酸、在通用碱基引物的3’-末端中的两个连续的核苷酸之外的区域。在代替性的实例中，两个通用碱基核苷酸位于核心区域，一个通用碱基核苷酸位于除了核心区域、在通用碱基引物的5’-末端中的三个连续的核苷酸、在通用碱基引物的3’-末端中的两个连续的核苷酸之外的区域。以下，详细说明通用碱基引物具有两个或三个通用碱基核苷酸的实例：(i)在通用碱基引物具有两个通用碱基核苷酸的情况下，在一实例中，两个通用碱基核苷酸位于核心区域。在另一实例中，一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的核心区域，其他通用碱基核苷酸位于从通用碱基引物的核心区域的5’最后核苷酸向5’方向的5、10以上的核苷酸以内。例如，在核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的情况下，其他通用碱基核苷酸位于在通用碱基引物的3’-末端中的第十一个核苷酸至第七个核苷酸、第十二个核苷酸至第七个核苷酸、第十三个核苷酸至第七个核苷酸、第十四个核苷酸至第七个核苷酸、第十五个核苷酸至第七个核苷酸或第十六个核苷酸至第七个核苷酸。在此情况下，可减少通用碱基引物的3’部分与另一个引物杂交的可能性。根据代替性的实例，一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的核心区域，其他通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的5’部分或3’部分，上述5’部分及3’部分可通过将通用碱基引物的核苷酸长度分成两部分来确定。有关对通用碱基核苷酸的限定，在本发明的一实例中，将通用碱基引物的整个核苷酸长度分成两部分。在通用碱基引物的总长度为偶数的情况下，将通用碱基引物均等地分成两部分，相反，在通用碱基引物的总长度为奇数的情况下，不能将通用碱基引物均等地分成两部分。在不能将通用碱基引物均等地分成两部分的情况下，可以增加或去除一个核苷酸。即，可通过去除位于5’-末端的任意核苷酸或者在5’-末端增加任意虚拟的核苷酸来将通用碱基引物准确地分成两部分。增加或去除任意核苷酸仅是为了将通用碱基引物准确地分成两部分，因此，不应解释为通用碱基核苷酸位于所增加或去除的核苷酸。代替性地，可通过去除位于3’-末端的任意核苷酸或者在3’-末端增加任意虚拟的核苷酸来将通用碱基引物准确地分成两部分。(ii)在通用碱基引物具有三个通用碱基核苷酸的情况下，根据一实例，一个通用碱基核苷酸位于核心区域，两个通用碱基核苷酸位于从通用碱基引物的核心区域的5’最后核苷酸向5’方向的5、10以上的核苷酸以内。例如，在通用碱基引物的3’-末端中的第十一个核苷酸至第七个核苷酸、第十二个核苷酸至第七个核苷酸、第十三个核苷酸至第七个核苷酸、第十四个核苷酸至第七个核苷酸、第十五个核苷酸至第七个核苷酸或第十六个核苷酸至第七个核苷酸。根据代替性的实例，一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的核心区域，其他通用碱基核苷酸位于从通用碱基引物的核心区域的5’最后核苷酸向5’方向的5、10以上的核苷酸以内，通过增加或去除核苷酸或者不增加或不去除核苷酸来将核苷酸长度分成两部分，从而可确定上述5’部分及3’部分。根据另一实例，一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的核心区域，另一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的5’部分、中间部分或3’部分，通过增加或去除一个或两个核苷酸或者不增加或不去除一个或两个核苷酸来将通用碱基引物的核苷酸长度分成三部分，从而确定上述三个部分，其他通用碱基核苷酸位于与上述另一个核苷酸相同或不同的部分。例如，一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的核心区域，另一个通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的5’部分，其他通用碱基核苷酸位于通用碱基引物的中间部分。如上所述的通用碱基的位置为例示性的，通用碱基核苷酸的其他位置可由普通技术人员考虑。若以如上所述的方式确定通用碱基核苷酸的位置，则在使用至少三个引物对的多重扩增反应中可通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。尤其，若以如上所述的方式使通用碱基位于通用碱基引物的5’部分，则抑制一条链可延伸的引物二聚体的形成，其结果，可防止如聚合酶及dntp的pcr反应的成分的消耗。根据本发明的一实例，通用碱基引物中的至少一个不包含多义碱基，根据一实例，在多重扩增反应中所使用的通用碱基引物中的至少1、2、3、4、5、6、8、10或12个不包含多义碱基。根据本发明的一实例，在多重扩增反应中所使用的通用碱基引物中的至少50％、60％或70％不包含多义碱基。根据本发明的一实例，在通用碱基引物具有多义碱基的情况下，多义碱基的数量不超过一个。根据另一实例，所有通用碱基引物不包含多义碱基。可通过使通用碱基核苷酸包含在本发明的引物来降低使用多义碱基的必要性。根据本发明的一实例，引物对中的至少一个引物对、至少两个引物对、至少三个引物对、至少四个引物对或至少五个引物对中的正向引物及反向引物均为通用碱基引物。根据本发明的一实例，每个引物对中的正向引物及反向引物中的一个或两个均为通用碱基引物。根据本发明的一实例，所使用的引物的总数的至少50％、60％、70％、80％或90％为通用碱基引物。根据本发明的一实例，引物均为通用碱基引物。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少三个引物对包含至少两个通用碱基引物。具体地，本文中所使用的至少三个引物对包含至少三个、至少四个、至少五个或至少六个通用碱基引物。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少四个引物对包含至少三个通用碱基引物。具体地，本文中所使用的至少四个引物对包含至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个通用碱基引物。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少五个引物对包含至少三个通用碱基引物。具体地，本文中所使用的至少五个引物对包含至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个通用碱基引物。根据本发明的一实例，本文中所使用的至少七个引物对包含至少四个通用碱基引物。具体地，本文中所使用的至少七个引物对包含至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个或至少十四个通用碱基引物。本发明中所使用的引物的长度可根据如引物的合成便利性及费用、以及扩增反应的准确性及敏感性等几种因素而不同。例如，非限制性地，本发明中所用的引物的长度为至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少18个核苷酸、至少20个核苷酸、至少22个核苷酸、至少24个核苷酸、至多60个核苷酸、至多50个核苷酸、至多40个核苷酸、至多35个核苷酸、至多30个核苷酸或至多25个核苷酸。根据本发明的一实例，引物的长度为12～60、12～50、12～40、12～35、12～30、12～25、15～60、15～50、15～40、15～35、15～30、15～25、20～60、20～50、20～40、20～35、20～30、20～25、22～60、22～50、22～40、22～35、22～30、22～25、24～60、24～50、24～40、24～35或24～30个核苷酸，具体地，引物的长度为20～30个核苷酸。根据本发明的一实例，本发明中利用的通用碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2’-脱氧肌苷、2-氮杂-2’-脱氧肌苷、2’-ome肌苷、2’-f肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2’-ome3-硝基吡咯、2’-f3-硝基吡咯、1-(2’-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吡咯、5-硝基吲哚、2’-ome5-硝基吲哚、2’-f5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2’-f水粉蕈素、2’-f4-硝基苯并咪唑、pna-5-introindole、pna-水粉蕈素、pna-肌苷、pna-4-硝基苯并咪唑、pna-3-硝基吡咯、吗啉基-5-硝基吲哚、吗啉基-水粉蕈素、吗啉基-肌苷、吗啉基-4-硝基苯并咪唑、吗啉基-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2’-o-甲氧基乙基肌苷、2’-o-甲氧基乙基水粉蕈素、2’-o-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2’-o-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2’-o-甲氧基乙基3-硝基吡咯及它们的组合组成的组中。更具体地，上述通用碱基为脱氧肌苷、肌苷或它们的组合。【步骤(b)：利用至少三个引物对的多重扩增反应】接着，利用步骤(a)的至少三个引物对来进行多重扩增反应，在上述反应包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环。在步骤(b)中，在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体的形成来生成靶核酸分子的扩增产物。本发明的多重扩增反应在封闭的单一容器中进行。可通过普通技术人员公知的多种引物-参与核酸扩增方法来进行靶核酸分子的多重扩增，其包括聚合酶链式反应(pcr)、连接酶链反应(ligasechainreaction(lcr))(美国专利第4683195号及第4683202号；pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(innisetal.，eds，1990))、链置换扩增(stranddisplacementamplification(sda))(walker，etal.nucleicacidsres.20(7):1691-6(1992)；walkerpcrmethodsappl3(1):1-6(1993))、转录介导的扩增(transcription-mediatedamplification)(phyffer，etal.，j.clin.microbiol.34:834-841(1996)；vuorinen，etal.，j.clin.microbiol.33:1856-1859(1995))、基于核酸序列的扩增(nucleicacidsequence-basedamplification(nasba))(compton，nature350(6313):91-2(1991))、滚环扩增(rollingcircleamplification，rca)(lisby，mol.biotechnol.12(1):75-99(1999)；hatchetal.，genet.anal.15(2):35-40(1999))及qβ复制酶(q-betareplicase)(lizardietal.，bioltechnology6:1197(1988))。本发明的多重扩增反应可通过实时pcr方法来进行(参照：美国专利5210015、5538848及6326145)。术语“多重扩增”是指同时扩增单一聚合酶反应混合物中的多重dna靶。用于多重扩增的靶核酸分子可包含dna(gdna或cdna)、rna分子及它们的杂交体(嵌合核酸)。序列可为双链或单链。在作为起始物质的核酸为双链的情况下，优选地，将双链制成单链或部分单链形态。分离链的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶促方法(例如，解螺旋酶作用)及结合蛋白，但并不限定于此。例如，链分离可通过在80～105℃的温度下进行加热来实现。用于实现这种处理的普通方法由josephsambrook，等，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2001)提供。在利用mrna作为起始物质的情况下，在退火步骤之前，需要进行逆转录步骤，有关逆转录步骤的详细内容在josephsambrook，等，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2001)及noonan，k.f.etal.，nucleicacidsres.16:10366(1988)中揭示。为了进行逆转录步骤，可使用可与mrna杂交的低聚核苷酸dt引物、随机六聚体或靶核酸分子互补低聚核苷酸。低聚核苷酸dt引物由dtmp形成，在将dt引物用作引物的情况下，dtmp中的一个以上可被其他dnmp代替。逆转录步骤可借助具有rnaseh活性的逆转录酶来进行。在利用具有rnaseh活性的酶的情况下，慎重选择反应条件，从而可省略单独的rnaseh剪切步骤。本发明中所使用的引物通过在模板的一个部位进行杂交或退货而形成双链。形成这种双链结构的合适的核酸杂交条件记载在josephsambrook，等，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2001)及haymes，b.d.，等，nucleicacidhybridization，apracticalapproach，irlpress，washington，d.c.(1985)中。在本发明的扩增步骤中可使用多种dna聚合酶，例如，其包含e.colidna聚合酶i的克列诺片段、热稳定性dna聚合酶及噬菌体t7dna聚合酶。具体地，聚合酶为可从多种细菌种类获得的热稳定性dna聚合酶，其包含thermusaquaticus(taq)、thermusthermophilus(tth)、thermusfiliformis、thermisflavus、thermococcusliteralis、thermusantranikianii、thermuscaldophilus、thermuschliarophilus、thermusflavus、thermusigniterrae、thermuslacteus、thermusoshimai、thermusruber、thermusrubens、thermusscotoductus、thermussilvanus、thermusspeciesz05、thermusspeciessps17、thermusthermophilus、thermotogamaritima、thermotoganeapolitana、thermosiphoafricanus、thermococcuslitoralis、thermococcusbarossi、thermococcusgorgonarius、thermotogamaritima、thermotoganeapolitana、thermosiphoafricanus、pyrococcusfuriosus(pfu)、pyrococcuswoesei、pyrococcushorikoshii、pyrococcusabyssi、pyrodictiumoccultum、aquifexpyrophilus及aquifexaeolieus。这些酶的大部分可从细菌自身分离或可在产业上利用。并且，本发明中所使用的聚合酶可从高水平表达编码上述聚合酶的克隆基因的细胞获得。当进行聚合反应时，可向反应容器提供过量所需要的成分。扩增反应中所需要的成分过量是指扩增反应实质上不受上述成分的浓度的程度的量。如mg2+的辅助因子、如datp、dctp、dgtp及dttp的dntp要求以达到所期望的扩增程度的量提供至反应混合物中。在扩增反应中所使用的所有酶可在相同的反应条件下具有活性。事实上，缓冲液使所有酶接近最佳反应条件。因此，本发明的多重扩增过程在不改变如反应物的添加等条件的情况下可进行单一反应。在本发明中，退火或杂交在可实现靶核酸序列与引物之间的特异性结合的严格条件下进行。用于退火的严格条件具有序列依赖性且根据环境变量为多种。根据本发明的一实例，在步骤(b)中的多重扩增反应中，在50℃以上的温度下进行引物退火。即使通用碱基引物含有通用碱基，但为了防止引物二聚体形成，可在相对高的退火温度下进行本发明的方法的扩增反应。在步骤(b)的多重扩增反应中，在50℃以上、52℃以上、55℃以上或57℃以上的温度下进行引物退火。具体地，在步骤(b)的多重扩增反应中，在85℃以下、80℃以下、75℃以下、70℃以下、65℃以下及60℃以下的温度下进行引物退火，例如，在50～85℃、50～80℃、50～75℃、52～75℃、55～75℃、50～70℃、52～70℃、55～70℃、50～60℃、52～60℃、55～60℃或57～60℃的温度下进行引物退火。使用通用碱基引物的与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应在存在用于检测每个靶核酸分子的存在的额外的至少三个探针的条件下进行。上述至少三个探针分别具有与相应的靶核酸分子杂交序列，并位于用于扩增靶核酸分子的正向引物及反向引物之间。在使用本发明的(多个)通用碱基引物的多重扩增反应中，探针的使用可提高靶核酸分子的检测特异性。可根据本领域中公知的多种方法来使用探针。作为上述方法的例，可举例taqmantm探针方法(美国专利第5210015号)、分子信标方法(tyagi等，naturebiotechnologyv.14march1996)、cpt(duckp，等.biotechniques，9:142-148(1990))、lna方法(美国专利第6977295号)、plexor方法(sherrillcb，等，journaloftheamericanchemicalsociety，126:4550-4556(2004))、hybeaconstm(d.j.french，etal.，molecularandcellularprobes(2001)13，363-374及美国专利第7348141号)、双标记的自身淬灭探针(dual-labeled，self-quenchedprobe；美国专利第5876930号)、杂交探针(bernardps，etal.，clinchem2000，46，147-148)、ptoce(ptocleavageandextension)方法(wo2012/096523)、pce-sh(ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo2013/115442)、pce-nh(ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(wo2014/104818)及cer方法(wo2011/037306)。根据本发明的一实例，至少三个探针不具有通用碱基核苷酸。根据本发明的一实例，探针可含有或不含有标记。根据本发明的一实例，根据靶核酸分子的存在，探针可介导下游反应(例如，ptoce反应)。本发明的方法相比于使用以往的引物的扩增反应，引物二聚体的形成降低。具体地，可通过对伴随在引物二聚体的形成的信号的变化进行检测来评价降低的引物二聚体的形成。代替性地，当评价降低的引物二聚体的形成时，可使用ct值的变化、最大rfu的变化、信号的变化率。在一实例中，可通过对在不存在靶核酸分子的条件下使用本发明的通用碱基引物的反应与在不存在靶核酸分子的条件下使用由自然产生核苷酸组成的以往的引物的反应之间的ct值进行比较来评价降低的引物二聚体的形成。为了进行上述比较，可使用含有与在靶核酸分子内的核苷酸互补的自然产生核苷酸的以往的引物来代替通用碱基核苷酸。根据本发明的一实例，在不存在靶核酸分子的条件下从使用包含通用碱基引物的引物对的反应获得的ct值(即，引物二聚体的ct值)相比于在不存在靶核酸分子的条件下从使用由以往的引物组成的引物对的反应获得的ct值增加1以上。在不存在靶核酸分子的条件下从使用包含通用碱基引物的引物对的反应获得的ct值相比于在不存在靶核酸分子的条件下从使用由以往的引物组成的引物对的反应获得的ct值增加2以上、3以上、4以上、5以上或6以上，例如，增加3至20，5至15或8至12。术语“引物二聚体的ct值”是指从在不存在任意模板的条件下通过使用pcr反应混合物的扩增反应来获得的引物二聚体的扩增曲线计算的ct值。因此，引物二聚体的ct值的增加表示引物二聚体的形成被抑制或降低。获得ct值的方法是在本领域中公知的(参照：josephsambrook，等，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2001))。在引物二聚体形成的抑制或降低非常有效的情况下，由于引物二聚体的低的扩增，可能无法从引物二聚体的扩增曲线获得ct值。在此情况下，视为引物二聚体的ct值增加1以上。本发明的方法产生现使用通用碱基引物的靶扩增反应相比于使用以往的引物的靶扩增反应所提高的靶扩增效率。通过对使用含有自然产生核苷酸的引物来扩增靶核酸分子而获得的信号及使用通用碱基引物来扩增靶核酸分子而获得的信号之间的差异(例如，ct值的变化、最大rfu的变化、信号的变化率等)进行比较来评价所提高的靶扩增效率。本文中所使用的术语“扩增效率”包括可产生扩增反应的效率的任一值。可通过本领域中公知的多种方法来计算扩增效率。在一实例中，基于稀释列的线性回归斜率计算扩增速度并基于下述方程式计算扩增效率，从而可推算出扩增效率(higuchietal.，1993；rasmussen，2001)。式1：e＝10-1/斜率在上述式中，e表示扩增效率，斜率(slope)表示对靶的初期拷贝数绘制ct值的标准曲线的斜率。在另一实例中，可通过本领域中钢制的任意程序来推算扩增效率。例如，可通过定量性rt-pcr(qpcr)数据分析用linregpcr(版本：2017.1)来计算扩增效率。在获取扩增效率时使用linregpcr的情况下，在原始(即，没有修改基线的)pcr数据分析中使用linregpcr。基线修改利用基于初期循环的选择的基线趋势来进行。从通过使用linregpcr对对数线性模型内的基线被修改的数据点的子集进行拟合的回归线的斜率导出与各个单独的样品有关的pcr效率。作为上述程序，使用具有代表性的单独线性窗口(window-of-linearity)，在部分样品的情况下，可设置单独线性窗口的上限及下限。使用通过上述方法中的一种获得的通用碱基引物的反应的效率可与使用以往的引物的反应的效率进行比较。使用通用碱基引物的反应的效率以相对于使用以往的引物的反应的提高率来表示。上述提高率可通过下述式来计算。式2：效率的提高率(％)＝[使用通用碱基引物的反应的效率/使用以往的引物的反应的效率]-1]×100根据本发明的一实例、在多重扩增反应中通过使用通用碱基引物来扩增靶核酸分子相比于通过使用由自然产生核苷酸组成的引物来扩增靶核酸分子产生3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％以上的效率的提高率。根据本发明的一实例，各反应的扩增效率通过linregpcr计算，使用通用碱基引物的反应的效率的提高率通过与使用以往的引物的反应进行比较来计算。根据本发明的第二实施方式，本发明提供在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中降低引物二聚体形成的方法，包括：步骤(a)，确定需要扩增的至少三个靶核酸分子；步骤(b)，确定分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对的核苷酸序列，上述每个引物包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列；步骤(c)，利用通用碱基核苷酸从上述至少三个引物对中的至少一个引物对中取代一个或两个引物中的1～3个核苷酸来制备通用碱基引物，利用上述通用碱基核苷酸所进行的取代抑制引物二聚体形成，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围的区域，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；步骤(d)，利用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应，上述多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。在本发明的一实例中，上述核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第五个核苷酸的范围。在本发明的一实例中，上述至少一个引物对中的两个引物为通用碱基引物。在本发明的一实例中，上述每个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物。在本发明的一实例中，所使用的引物的总数中的最少50％为通用碱基引物。在本发明的一实例中，上述通用碱基引物中的至少一个不包含多义碱基。在本发明的一实例中，至少五个引物对使用于至少五个靶核酸分子的扩增。在本发明的一实例中，在上述多重扩增反应中，在50℃以上的温度下进行引物退火。在本发明的一实例中，相比于使用包含与上述靶核酸序列互补的自然产生核苷酸(a、c、g或t(u))的引物来代替上述至少一个通用碱基引物时，上述方法产生至少高3％的靶扩增效率。在本发明的一实例中，在不存在靶核酸分子的条件下从使用包含通用碱基引物的引物对的反应获得的ct值相比于在不存在靶核酸分子的条件下从使用由以往的引物组成的引物对的反应获得的ct值增加1以上。在本发明的一实例中，为了检测上述靶核酸分子的存在而在存在至少三个额外的探针的条件下进行上述多重扩增反应，每个上述至少三个探针包含与需要扩增的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列且位于正向引物及反向引物之间。在本发明的一实例中，上述至少三个探针不具有通用碱基核苷酸。在本发明的一实例中，上述通用碱基核苷酸选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2’-脱氧肌苷、2-氮杂-2’-脱氧肌苷、2’-ome肌苷、2’-f肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2’-ome3-硝基吡咯、2’-f3-硝基吡咯、1-(2’-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吡咯、5-硝基吲哚、2’-ome5-硝基吲哚、2’-f5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2’-f水粉蕈素、2’-f4-硝基苯并咪唑、pna-5-introindole、pna-水粉蕈素、pna-肌苷、pna-4-硝基苯并咪唑、pna-3-硝基吡咯、吗啉基-5-硝基吲哚、吗啉基-水粉蕈素、吗啉基-肌苷、吗啉基-4-硝基苯并咪唑、吗啉基-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2’-o-甲氧基乙基肌苷、2’-o-甲氧基乙基水粉蕈素、2’-o-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2’-o-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2’-o-甲氧基乙基3-硝基吡咯及它们的组合组成的组中。在本发明的一实例中，上述通用碱基核苷酸包含脱氧肌苷、肌苷或它们的组合。作为本发明的第二实施方式的“在多重扩增反应中降低引物二聚体形成的方法”为如上所述的第一实施方式的应用。因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过度的重复，省略它们之间的共同的说明。根据本发明的第三实施方式，本发明提供用于在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的试剂盒，包含：(a)至少三个引物对，分别包含正向引物及反向引物，每个引物包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围的区域，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；(b)核酸聚合酶。根据本发明的第四实施方式，本发明提供用于在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的试剂盒在权利要求1所述的在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法中的用途，上述用于在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的试剂盒包含：(a)至少三个引物对，分别包含正向引物及反向引物，每个引物包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围的区域，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；(b)核酸聚合酶。本发明的用于扩增至少三个靶核酸分子的试剂盒或试剂盒的用途用于执行如上所述的本发明的方法，为了避免导致本说明书的复杂性的过度的重复，省略它们之间的共同的说明。可选地，本发明的试剂盒可包含在pcr反应中所需要的如缓冲液、dna聚合酶、dna聚合酶辅助因子及脱氧核糖核苷酸-5’-三磷酸等试剂。可选地，本发明的试剂盒可包含多种多聚核苷酸分子、逆转录酶、多种缓冲液及试剂、用于抑制dna聚合酶活性的抗体。并且，本发明的试剂盒还可包含在阳性及阴性对照组反应中所需要的试剂。在特定反应中所使用的实际的最佳量可由本领域的普通技术人员容易地确定。代表性地，本发明的试剂盒在分离的包装或分隔间包含如上所述的成分。根据本发明的第五实施方式，本发明提供计算机可读存储介质，上述计算机可读存储介质包括被配置为执行以下工作的指令：设计分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对，每个引物包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围的区域，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性。存储介质用于在计算机执行本发明的方法，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过度的重复，省略它们之间的共同的说明。如上所述的本发明的方法可由处理器执行，例如，独立计算机、网络连接的计算机或如实时pcr设备的数据收集装置内的处理器。计算机可读存储介质的类型包括如cd-r、cd-rom、dvd、快闪存储器、软盘、硬盘驱动器、便携式hdd、usb、磁带、minidisc、非易失性存储卡、eeprom、光盘、光存储介质、ram、rom、系统存储器及网络服务器等多种存储介质。本实现执行本发明的处理器的多个指示可包括在逻辑系统。上述指示虽然以如便携式hdd、usb、软盘、cd及dvd等任何软件存储介质形式提供，但可以进行下载并存储于存储器模块(例如，硬盘驱动器、本地或附着ram或rom等其他存储器)。用于执行本发明的计算机代码可由如c、c++、java、visualbasic、vbscript、javascript、perl及xml等多种编码语言执行。并且，在本发明的数据和指令的外部及内部存储、传输中可利用多种语言及协议。【发明的效果】本发明的特征及优点为如下：(a)多重核酸扩增反应中的二聚体形成的抑制本发明的方法有效抑制在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中的扩增产物，尤其引物二聚体的形成。(b)核酸扩增效率的提高引物二聚体，尤其完全延伸的引物二聚体的形成防止引物参与靶的扩增。并且，随着扩增的进行，由引物二聚体生成的非靶扩增产物与靶核酸分子竞争性结合且消耗包含引物的扩增成分，从而降低靶的库增效率。本发明的方法通过在初期循环中抑制这种二聚体形成来提高核酸扩增效率。(c)对低浓度靶敏感度提高在初期样品中存在少量的靶核酸分子的情况下，靶核酸分子的扩增量比引物对的扩增量更低，因此会检测不到。但是，在通过本发明的方法来降低二聚体形成的情况下，即使存在少量的靶核酸分子，也可以检测到靶核酸，因此可改善敏感度。(d)通过所改善的扩增效率容易组成用于多重核酸扩增的引物集为了抑制引物之间的二聚体形成并改善扩增效率而反复调节引物的杂交部位及引物的序列和长度是需要消费相当多的时间且效率低。尤其，在使用多个引物的多重扩增反应的情况下，变更一个引物的序列或长度需要通过考虑与其他引物之间的二聚体形成可能性来进行。由于这种原因，在多重扩增反应中为了降低二聚体形成且提高扩增效率而调节整体引物是难以实现的。与此相反，本发明的方法在不改变引物的杂交部位或不变更引物的序列或长度的情况下也可以抑制二聚体的形成，因此，有利于为了多重扩增反应而组成二聚体形成被抑制的引物基。【附图说明】图1示出本发明的通用碱基引物(ubp)的简要结构。通用碱基引物包含包括在两末端没有通用碱基的两个区域及核心区域的通用碱基区域。图2示出可在多重扩增反应中偶然生成的如不可延伸的引物二聚体(上部列)、一条链可延伸的引物二聚体(中间列)及两条链可延伸的引物二聚体(下部列)等引物二聚体的三种类型。图3示出与分别使用用于形成不可延伸的引物二聚体对的引物集#1-3(上部左侧)及#11-13(上部右侧)、用于形成一条链可延伸的引物二聚体的引物集#4-6(中间左侧)及#14-16(中间右侧)以及用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物集#7-10(下部左侧)及#17-20(下部右侧)来获得的引物二聚体有关的扩增曲线。图4示出与分别使用up对照组引物集及ng对照组引物集(第一列)、用于形成不可延伸的引物二聚体对的引物集#21-23及#31-33(第二列)、用于形成一条链可延伸的引物二聚体的引物集#24-26及#34-36(第三列)以及用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物集#27-30及#37-40(第四列)来获得的靶核酸分子(up及ng)有关的扩增曲线。图5a示出与分别使用引物集#9(第一列，左侧)、引物集#9a(第一列，右侧)、引物集#9b(第二列，左侧)、引物集#9c(第二列，右侧)、引物集#9d(第三列，左侧)、引物集#9e(第三列，右侧)、引物集#9f(第四列，左侧)及引物集#9g(第四列，右侧)来获得的引物二聚体有关的扩增曲线。图5b示出与分别使用引物集#19(第一列，左侧)、引物集#19a(第一列，右侧)、引物集#19b(第二列，左侧)、引物集#19c(第二列，右侧)、引物集#19d(第三列，左侧)、引物集#19e(第三列，右侧)、引物集#19f(第四列，左侧)及引物集#19g(第四列，右侧)来获得的引物二聚体有关的扩增曲线。图6a示出与分别使用引物集#29(第一列，左侧)、引物集#29a(第一列，右侧)、引物集#29b(第二列，左侧)、引物集#29c(第二列，右侧)、引物集#29d(第三列，左侧)、引物集#29e(第三列，右侧)、引物集#29f(第四列，左侧)及引物集#29g(第四列，右侧)来获得的靶核酸分子up有关的扩增曲线。为了进行比较，使用没有用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物(up-c-3)的引物集#29及#29a-#29g来获得扩增曲线。在附图中，“-o-”表示与引物集#29及#29a-#29g有关的结果，“-x-”表示与没有用于形成引物二聚体的引物(up-c-3)的引物集有关的结果。图6b示出与分别使用引物集#39(第一列，左侧)、引物集#39a(第一列，右侧)、引物集#39b(第二列，左侧)、引物集#39c(第二列，右侧)、引物集#39d(第三列，左侧)、引物集#39e(第三列，右侧)、引物集#39f(第四列，左侧)及引物集#39g(第四列，右侧)来获得的靶核酸分子ng有关的扩增曲线。为了进行比较，使用没有用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物(ng-c-3)的引物集#39及#39a-#39g来获得扩增曲线。在附图中，用”-o-”表示与引物集#39及#39a-#39g有关的结果，用”-x-”表示与没有用于形成引物二聚体的引物(ng-c-3)的引物集有关的结果。图7示出与使用以往的引物混合物(-o-)、第一通用碱基引物混合物(-δ-)及第二通用碱基引物混合物(-□-)来获得的引物二聚体有关的扩增曲线。图8示出与存在10pg(-o-)、1pg(-δ-)、0.1pg(-□-)及ntc(-x-)的浓度的靶核酸分子的条件下使用以往的引物混合物(左侧栏)、第一通用碱基引物混合物(中间栏)及第二通用碱基引物混合物(右侧栏)来获得的核酸分子uu、mg、ng及ct有关的扩增曲线。【具体实施方式】以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施列仅用于更具体地说明本发明，对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员而言，根据本发明的要旨本发明的范围并不限定于这些实施例是显而易见的。【实施例】【实施例1：确认影响二聚体扩增及靶扩增的二聚体的类型】本发明人调查了与二聚体扩增及靶扩增有关的引物二聚体的类型及引物二聚体内的互补核苷酸的长度的影响。<1-1>促进二聚体扩增的引物二聚体类型可根据每个引物链是否延伸来将可在多重扩增反应中偶然生成引物二聚体分为三种类型：(i)不可延伸的引物二聚体；(ii)一条链可延伸的引物二聚体；以及(iii)两条链可延伸的引物二聚体(参照图2)。第一，不可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链不被核酸聚合酶延伸的引物二聚体。这种类型可通过两个引物的5’部分之间的杂交来形成(参照图2的上部列)。第二，一条链可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链中的一个被核酸聚合酶延伸的引物二聚体。这种类型可通过一个引物的3’部分与另一个引物的中间部分之间的杂交来形成(参照图2的中间列)。第三，两条链可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链被核酸聚合酶延伸的引物二聚体。这种类型可通过两个引物的3’部分之间的杂交来形成(参照图2的下部列)。为了描述上述三种类型的引物二聚体的形成，制备了用于与作为靶核酸序列的ureaplasmaparvum(up)及neisseriagonorrhoeae(ng)的基因组dna杂交的以往的引物(up-r1，序列号：1；ng-f4，序列号：12)。然后，制备了可形成以往的引物和不可延伸的引物二聚体、一条链可延伸的引物二聚体及两条链可延伸的引物二聚体中的一个的额外的引物。将用于二聚体形成的引物设计为具有与up-r1(序列号：1)及ng-f4(序列号：12)有关的多种长度的互补核苷酸的引物。具体地，将up-r1或ng-f4和用于形成不可延伸的引物二聚体的三个引物(分别与up有关的up-n-1、up-n-2及up-n-3；分别与ng有关的ng-n-1、ng-n-2及ng-n-3)以使它们不具有作为与以往的引物有关的模板可启动的突出(protruding)核苷酸的方式制备，为了防止它们的3’-末端的延伸而进行封闭。以使它们对以往的引物具有11、13或15个互补核苷酸方式制备。并且，将up-r1或ng-f4和用于形成一条链可延伸的引物二聚体的三个引物(分别与up有关的up-p-1、up-p-2及up-p-3；分别与ng有关的ng-p-1、ng-p-2及ng-p-3)以使它们提供作为与以往的引物有关的模板启动的核苷酸的方式制备，为了防止它们的3’-末端的延伸而进行封闭。尤其，以使它们具有与以往的引物的3’-部分互补的5、7或9个3’部分的方式制备。并且，将up-r1或ng-f4和用于形成两条链可延伸的引物二聚体的四个引物(分别与up有关的up-c-1、up-c-2、up-c-3及up-c-4；分别与ng有关的ng-c-1、ng-c-2、ng-c-3及ng-c-4)以使它们在3’部分具有与以往的引物的3’部分互补的4、5、6或7个核苷酸的方式制备。其结果，为了形成三种类型的引物二聚体而制备了分别包含up-r1及ng-f4中的一个和用于形成如上所述的二聚体的引物中的一个的引物集#1至引物集#20。本实施例中所使用的引物的序列分别在表1及表2中提供。【表1】(划线部分表示与up-r1有关的互补序列)【表2】(划线部分表示与ng-f4有关的互补序列)在本实施例中，使用利用作为插入染料的greeni(invitrogen，usa)的实时pcr来在不存在任意靶核酸序列的条件下检测引物二聚体形成。在形成并扩增引物二聚体的情况下，失去活性的greeni混入引物二聚体内之后被激活而呈现出荧光。可通过对来自在引物二聚体内的上述被激活的染料的信号进行检测来获得扩增曲线。在引物二聚体扩增中使用了具有5’核酸酶活性的taqdna聚合酶。利用含有每个引物集(3pmole的引物(序列号：1及12)中的一个及10pmole的引物(序列号：2-11及13-22)中的一个)、2μl的greeni以及5μl的4xmastermix[final，200um的dntps、2mm的mgcl2、2u的taqdna聚合酶]的20μl的最终体积来进行实时pcr。将含有反应混合物的试管放置于50℃的实时热循环仪(cfx96，bio-rad)中5分钟，在95℃的温度下进行变性15分钟，分别在95℃、57℃、72℃的温度下进行10秒钟、60秒钟、10秒钟，并循环50次。在每次循环中，在57℃的温度下进行信号检测。从上述实验获得的扩增曲线在图3中示出。如图3所示，在用于形成不可延伸的引物二聚体的引物集#1-3及#11-13(参照图3的上部列)以及用于形成一条链可延伸的引物二聚体的引物集#4-6及#14-16(参照图3的中间列)中没有观察到与引物二聚体有关的扩增曲线。与此相反，在用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物集#7-10及#17-20中观察到与引物二聚体有关的扩增曲线(参照图3的下部列)。尤其，引物二聚体内的互补序列的长度越长，产生二聚体扩增更早。这些结果表明，三种类型的引物二聚体中的两条链可延伸的引物二聚体促进二聚体扩增，引物二聚体内的4～7个互补核苷酸的长度为二聚体形成的原因。<1-2>影响靶扩增的引物二聚体类型调查了影响靶扩增的，即，抑制靶扩增的引物二聚体的类型。先制备了用于扩增靶核酸序列的正向引物及反向引物(在up的情况下，序列号：23及1；在ng的情况下，序列号：12及24)。然后，制备了可形成正向引物及反向引物中的一个和每个类型的引物二聚体的额外的引物(序列号：2-11)。之后，通过将上述正向引物及反向引物与上述额外的引物中的一个组合来获得多种引物集#21-40。将可形成每个类型的引物二聚体的额外的引物的引物集用作对照组。本实施例中所使用的引物集在表3及表4中提供。【表3】(划线部分表示与up-r1有关的互补序列)【表4】划线部分表示与ng-f4有关的互补序列)在本实施例中，使用taqman探针作为信号产生单元来检测靶扩增。在存在靶核酸的情况下，taqman探针被切断而释放出被标记的片段。用荧光报告分子将与每个靶核酸序列有关的taqman探针在其5’-末端进行标记并用猝灭分子在其3’-末端进行标记(序列号：25及26)。可通过检测来自上述所标记的片段的信号来获得扩增曲线。本实施例中额外使用的探针额序列在下列表5中提供。【表5】名称序列序列号up-p15’-[fam]cccagctattgcacatggtgttgat[bhq-1]-3’25ng-p25’-[calfluorred610]tgtacggctccgttgtggcggt[bhq-2]-3’26(bhq：黑洞淬灭)(fam及calfluorred610：荧光报告分子)利用含有每个引物集(3pmole的正向引物及3pmole的反向引物以及10pmole的用于形成引物二聚体的引物)、3pmole的taqman探针、靶核酸序列(0.1pg的up或0.1pg的ng)以及5μl的4xmastermix[final，200um的dntps、2mm的mgcl2、2u的taqdna聚合酶]的20μl的最终体积来进行实时pcr。将含有反应混合物的试管放置于50℃的实时热循环仪(cfx96，bio-rad)中5分钟，在95℃的温度下进行变性15分钟，分别在95℃、57℃、72℃的温度下进行10秒钟、60秒钟、10秒钟，并循环50次。在每次循环中，在95℃的温度下进行信号检测。从上述实验获得的扩增曲线在图4中示出。如图4所示，不可延伸的引物二聚体(引物集#21-23及#31-33；第二列)及一条链可延伸的引物二聚体(引物集#23-26及#34-36；第三列)对靶核酸分子的扩增产生的影响并不明显，相反，两条链可延伸的引物二聚体(引物集#27-30及#37-40；第四列)相比于使用对照组引物集的对靶核酸分子的扩增产生的影响更明显。为了更好地理解引物二聚体对靶扩增的影像，通过如下式计算δct值。δct＝[具有用于形成引物二聚体的引物的反应中的ct]-[没有用于形成引物二聚体的引物二聚体的反应中的ct]适用阈值500来获得上述ct值，将大于1.0的δct值视为表示靶核酸分子的扩增由引物二聚体抑制。计算出的δct值在下列表6中提供。【表6】如表6所示，不可延伸的引物二聚体及一条链可延伸的引物二聚体产生1.0以下的δct值，这表示不可延伸的引物二聚体及一条链可延伸的引物二聚体对靶扩增产生的影响不明显。与此相反，具有至少6-mer的互补序列的两条链可延伸的引物二聚体(up及ng两者都)产生大于1.0的δct值，这表示两条链可延伸的引物二聚体，尤其在二聚体内具有至少六个互补核苷酸的两条链可延伸的引物二聚体妨碍靶扩增。由实施例<1-1>和<1-2>的结果可知，在内部具有5个以下的互补核苷酸的两条链可延伸的引物二聚体的形成虽然促进二聚体扩增但对靶扩增的抑制效果不明显，在内部具有六个以上的互补核苷酸的两条链可延伸的引物二聚体的形成不仅促进二聚体扩增，而且还抑制靶扩增。因此，推测出，为了防止由在其3’-末端部分具有六个以上的互补核苷酸的可延伸的引物二聚体导致的靶扩增的抑制，在位于引物的3’-末端的第六个或小于其的核苷酸(第五个、第四个、第三个等)排列通用碱基(例如，脱氧肌苷)是更有效果的。【实施例2：在多种位置具有通用碱基核苷酸的通用碱基引物对二聚体扩增及靶扩增的影响的评价】<2-1>在多种位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物对二聚体形成的影响在本实施例中，将在多种位置具有通用碱基的通用碱基引物对两条链可延伸的引物二聚体的扩增的影响与以往的引物进行比较。为了进行本实验，通过使确定为形成两条链可延伸的引物二聚体的两个以往的引物对中的一个((i)引物集#9中的up-r1(序列号：1；引物集#19中的ng-f4(序列号：12))变形来制备多种通用碱基引物。具体地，将通用碱基引物以用脱氧肌苷取代位于其3’-末端的第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个及第八个位置的自然产生核苷酸来使在其3’-末端的第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个及第八个位置含有脱氧肌苷的方式制备。通过将两个以往的引物对中的一个(up-c-3(序列号：10)或ng-c-3(序列号：23))与通用碱基引物中的一个组合来获得多种引物集(称为引物集#9a-9g及19a-19g)。本文中所使用的引物集在下列表7中提供。【表7】(在up-c-3中，划线部分表示与up-r1有关的互补序列；在ng-c-3中，划线部分表示与ng-f4有关的互补序列)利用含有每个引物集(3pmole的以往的引物up-r1(序列号：2)及通用碱基引物(序列号：27-33)中的一个以及10pmole的up-c-3(序列号：10)，或者3pmole的以往的引物ng-f4(序列号：13)或通用碱基引物(序列号：34-40)中的一个以及10pmole的ng-c-3(序列号：21))、2μl的greeni以及5μl的4xmastermix[final，200um的dntps、2mm的mgcl2、2u的taqdna聚合酶]的20μl的最终体积来进行实时pcr。将含有反应混合物的试管放置于50℃的实时热循环仪(cfx96，bio-rad)中5分钟，在95℃的温度下进行变性15分钟，分别在95℃、57℃、72℃的温度下进行10秒钟、60秒钟、10秒钟，并循环50次。在每次循环中，在57℃的温度下进行信号检测。与上述所获得的引物二聚体有关的扩增曲线在图5a及图5b中示出。如图5a及图5b所示，在引物集#9a-9e及#19a-19e(包含在第二个、第三个、第四个、第五个及第六个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)中没有观察到或生成与引物二聚体有关的扩增曲线，相反，在引物集#19f及#19g(包含在第七个及第八个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)中观察到与引物二聚体有关的扩增曲线。为了更好地理解通用碱基引物对引物二聚体形成的抑制产生的影响，通过如下式计算δct值。δct＝[与含有通用碱基引物的引物集有关的ct]-[与以往的引物集有关的ct]适用阈值500来获得上述ct值，将大于1.0的δct值视为表示二聚体扩增由通用碱基引物抑制计算出的δct值在下列表8中提供。【表8】(n/a：不可以适用)(括号内的数字表示引物内的脱氧肌苷的位置)如表8所示，在引物集#9a-9e及#19a-19e(包含在第二个、第三个、第四个、第五个及第六个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)的情况下，抑制二聚体扩增，但在引物集#9f、#9g、#19f及#19g(包含在第七个及第八个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)的情况下，不抑制二聚体扩增。上述结果证明，在其3’-末端的第二个至第六个位置含有脱氧肌苷的通用碱基引物有效防止二聚体扩增。<2-2>在多种位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物对靶扩增的影响在本实施例中，将在多种位置具有通用碱基的通用碱基引物对靶扩增的影响与以往的引物进行比较。为了进行本实验，先制备了用于扩增靶核酸分子的两个以往的引物(在up的情况下，引物集#29，或者，在ng的情况下，引物集#39)及用于形成两条链可延伸的引物二聚体的一个引物。然后，通过使用于扩增靶核酸分子的两个以往的引物中的一个变形来制备多种通用碱基引物。如实施例<2-1>所述，将通用碱基引物使其在多种位置含有脱氧肌苷的方式制备。其结果，将用于扩增靶核酸分子的以往的引物及通用碱基引物与用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物组合来获得多种引物集。在扩增的检测中还使用了taqman实时探针(序列号：25及26)。所使用的引物集在下列表9中提供。【表9】(在up-c-3中，划线部分表示与up-r1有关的互补序列；在ng-c-3中，划线部分表示与ng-f4有关的互补序列)具体地，利用含有每个引物集(3pmole的用于up-靶扩增的以往的正向引物up-f1(序列号：23)及3pmole的以往的反向引物up-r1(序列号：1)及通用碱基引物(序列号：27-33)中的一个，以及10pmole的用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物(序列号：10)，或者3pmole的用于ng-靶扩增的以往的反向引物ng-r2(序列号：14)及3pmole的以往的正向引物ng-f4(序列号：13)及通用碱基引物(序列号：34-40)中的一个，以及10pmole的用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物(序列号：21))、靶核酸序列(0.1pg的up或0.1pg的ng)以及5μl的4xmastermix[final，200um的dntps、2mm的mgcl2、2u的taqdna聚合酶]的20μl的最终体积来进行实时pcr。将含有反应混合物的试管放置于50℃的实时热循环仪(cfx96，bio-rad)中5分钟，在95℃的温度下进行变性15分钟，分别在95℃、57℃、72℃的温度下进行10秒钟、60秒钟、10秒钟，并循环50次。在每次循环中，在95℃的温度下进行信号检测。为了进行比较，利用没有用于形成两条链可延伸的引物二聚体的引物(up-c-3(序列号：10)或ng-c-3(序列号：21))的引物集来进行实时pcr。从每个引物基获得的扩增曲线在图6a及6b中示出。在附图中，“-x-”表示与没有用于形成引物二聚体的引物(up-c-3或ng-c-3)的引物集有关的结果，“-o-”表示与具有用于形成引物二聚体的引物(up-c-3或ng-c-3)的引物集有关的结果。适用阈值150及400来分别计算up及ng的ct值后，通过如下式计算δct值。δct＝[在存在用于形成引物二聚体的引物的条件下的反应中的ct]-[在不存在用于形成引物二聚体的引物的条件下的反应中的ct]计算出的δct值在下列表表10及表11中提供。【表10】【表11】在不存在用于形成引物二聚体的引物的条件下的扩增曲线的检测及1.0以下的δct值表示，与是否存在用于形成引物二聚体的引物存无关地，成功地扩增靶核酸序列。如表10及表11所示，引物集#29及#39在不存在用于形成引物二聚体的引物的条件下都能扩增up及ng，但是，在存在用于形成引物二聚体的引物的条件下不能扩增up及ng。另一方面，引物集#29a及#39a(包含分别在第二个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)在不存在用于形成引物二聚体的引物的条件下也不能扩增up及ng，但是，引物集#29b-29e及39b-39e(包含分别在第三个、第四个、第五个或第六个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)在存在或不存在用于形成引物二聚体的引物的条件下可扩增up及ng，引物集#29f-29g及#39f-39g(包含分别在第七个或第八个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物)在不存在用于形成引物二聚体的引物的条件下成功地扩增up及ng，但是，在存在用于形成引物二聚体的引物的条件下不能扩增up及ng。上述结果证明，在内部的3’-末端的第三个至第六个位置具有脱氧肌苷的通用碱基引物对靶扩增产生影响并不明显。综上所述，可理解，通过使用在内部的从3’-末端第三个至第六个位置含有用碱基核苷酸的通用碱基引物来抑制引物二聚体形成，从而可改善靶扩增。【实施例3：通用碱基引物的效果的验证】本发明人对在引物内的从3’-末端第三个至第六个核苷酸含有通用碱基的本发明的通用碱基引物是否在多重扩增反应中实际抑制引物二聚体的形成进行了验证。<3-1>通用碱基引物在引物二聚体形成抑制中的有用性为了进行本实验，通过如下方式制备了三种不同类型的引物混合物：(i)以往的引物混合物；(ii)第一通用碱基引物混合物；以及(iii)第二通用碱基引物混合物。上述引物混合物(i)-(iii)分别由用于扩增作为四个靶核酸序列的解脲支原体(ureaplasmaurealyticum，uu)、生殖支原体(mycoplasmagenitalium，mg)、淋球菌(neisseriagonorrhoeae，ng)及沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis，ct)基因组dna的四个引物对组成，每个引物对包含正向引物及反向引物。具体地，以往的引物混合物由在序列内不含有脱氧肌苷的八个以往的引物组成，将其用作对照组。第一通用碱基引物混合物由四个正向通用碱基引物(含有一个脱氧肌苷)及四个反向以往的引物组成。第二通用碱基引物混合物由四个正向通用碱基引物(含有两个脱氧肌苷)及四个反向以往的引物组成。通过用脱氧肌苷取代以往的引物内的一个或两个天然碱基来制备通用碱基引物。以往的引物混合物、第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物内的引物的序列在下列表12中提供。【表12】具体地，利用含有以往的引物混合物(序列号：41-48)、第一通用碱基引物混合物(序列号：49、42、50、44、51、46、52及48)或3pmole的第二通用碱基引物(序列号：53、42、54、44、55、46、56及48)内的每个引物2μl的greeni以及5μl的4xmastermix[final，200um的dntps、2mm的mgcl2、2u的taqdna聚合酶]的20μl的最终体积来进行实时pcr。将含有反应混合物的试管放置于50℃的实时热循环仪(cfx96，bio-rad)中5分钟，在95℃的温度下进行变性15分钟，分别在95℃、57℃、72℃的温度下进行10秒钟、60秒钟、10秒钟，并循环50次。在每次循环中，在57℃的温度下进行信号检测。从上述实验获得的扩增曲线在图7中示出。之后，为了评价二聚体扩增程度，适用阈值500来计算循环阈值(ct)。其结果显示，与第一通用碱基引物混合物、第二通用碱基引物混合物有关的ct值(即，分别为40.36及41.2)高于与以往的引物混合物有关的ct值(即，22.71)。上述结果表示，使用本发明的通用碱基引物，尤其，在引物内的从3’-末端第三个至第六个核苷酸含有通用碱基的本发明的通用碱基引物相比于使用以往的引物在多重扩增反应中可有效抑制二聚体形成及扩增。<3-2>通用碱基引物在靶扩增增加中的有用性在本实施例中，适用taqman探针作为信号产生单元来检测多重靶扩增。本实施例中额外使用的探针额序列在下列表13中提供。【表13】名称序列序列号uu-p15’-[fam]cacttcaccagatacataacccccgcc[bhq-1]-3’56mg-p15’-[calfluororange560]acacctcttgctgttcttgaaagaactc[bhq-1]-3’57ng-p15’-[calfluorred610]tgcccctcattggcgtgtttcg[bhq-2]-3’58ct-p15’-[quasar705]cattgtaaagatatggtctgcttcgaccg[bhq-3]-3’59(bhq：黑洞淬灭)(fam，calfluororange560，calfluorred610，及quasar705：荧光报告分子)具体地，利用含有以往的引物混合物(序列号：41-48)、第一通用碱基引物混合物(序列号：49、42、50、44、51、46、52及48)或3pmole的第二通用碱基引物(序列号：53、42、54、44、55、46、56及48)内的每个引物、四个靶核酸序列(0(ntc)、0.1、1或10pg的每个基因组dna以及5μl的4xmastermix[final，200um的dntps、2mm的mgcl2、2u的taqdna聚合酶]的20μl的最终体积来进行实时pcr。将含有反应混合物的试管放置于50℃的实时热循环仪(cfx96，bio-rad)中5分钟，在95℃的温度下进行变性15分钟，分别在95℃、57℃、72℃的温度下进行10秒钟、60秒钟、10秒钟，并循环50次。在每次循环中，在95℃的温度下进行信号检测。从上述实验获得的扩增曲线在图8中示出。如图8所示，以往的引物混合物不能扩增多种浓度的四个靶核酸序列中的大部分。相反，第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物均能够扩增所有靶核酸序列。之后，为了比较所使用的引物混合物之间的靶扩增效率，分别适用阈值150、100、400及500来计算uu、mg、ng及ct的ct值。结果在下列表14中提供。【表14】n/a：不可以适用ntc：没有模板对照组如表14所示，以往的引物混合物可有效扩增多种浓度的十二个靶核酸序列中的几个靶核酸序列，即，10pg的uu、10pg、1pg及0.1pgng、以及10pg的ct。相反，包含每个本发明的通用碱基引物的第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物都能有效扩增十二个靶核酸序列。为了还对本发明的方法对靶扩增效率产生的影响进行评价，使用作为用于定量性rt-pcr(qpcr)数据分析的以往的程序的linregpcr(版本：2017.1)来计算扩增效率。上述程序使用输入原始数据来计算扩增效率并输出(能够以百分比为基准变换所输出的扩增效率)。在本实施例中，通过上述程序获得与使用以往的引物混合物、第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物中的一个的每个反应有关的扩增效率之后，通过如下式计算第一通用碱基引物混合物或第二通用碱基引物混合物的效率的提高率。式2：效率的提高率(％)＝[使用通用碱基引物的反应的效率/使用以往的引物的反应的效率]-1]×100结果在下列表15中提供。【表15】如表15所示，使用第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物的反应中的一部分相比于以往的引物混合物呈现出更突出的效率的提高率(在“提高率”栏中用“>>100％”表示)，在使用以往的引物混合物的反应中没有确定扩增效率，这是因为在使用第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物的反应中已被确定。并且，使用第一通用碱基引物混合物及第二通用碱基引物混合物的反应中的一部分相比于使用以往的引物混合物的反应显示3.3％～59.9％的效率的提高率。上述结果表示，使用本发明的通用碱基引物，尤其在引物内的从3’-末端第三个至第六个核苷酸含有通用碱基的本发明的通用碱基引物相比于使用以往的引物可改善靶扩增效率。以上，详细说明了本发明的特定部分，对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员而言，这些具体描述仅为优选的实例且本发明的范围并不限定于此是显而易见的。因此，本发明的实质性范围由所附的发明要求保护范围和其等价物定义。序列表<110>seegene,inc.<120>降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法<130>pp170096<150>kr10-2016-0182955<151>2016-12-29<160>56<170>kopatentin3.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-r1<400>1ggttctcaagcaacaatatcagct24<210>2<211>11<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-n-1<400>2agctgatattg11<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-n-2<400>3agctgatattgtt13<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-n-3<400>4agctgatattgttgc15<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-p-1<400>5ttggcttggcttggcttagctg22<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-p-2<400>6ttggcttggcttggcttagctgat24<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-p-3<400>7ttggcttggcttggcttagctgatat26<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-c-1<400>8ttggcttggcttggcttagct21<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-c-2<400>9ttggcttggcttggcttagctg22<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-c-3<400>10ttggcttggcttggcttagctga23<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-c-4<400>11ttggcttggcttggcttagctgat24<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-f4<400>12gcggacagttgtttttcgact21<210>13<211>11<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-n-1<400>13agtcgaaaaac11<210>14<211>13<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-n-2<400>14agtcgaaaaacaa13<210>15<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-n-3<400>15agtcgaaaaacaact15<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-p-1<400>16ttggcttggcttggcttagtcg22<210>17<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-p-2<400>17ttggcttggcttggcttagtcgaa24<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-p-3<400>18ttggcttggcttggcttagtcgaaaa26<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-c-1<400>19ttggcttggcttggcttagtc21<210>20<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-c-2<400>20ttggcttggcttggcttagtcg22<210>21<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-c-3<400>21ttggcttggcttggcttagtcga23<210>22<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-c-4<400>22ttggcttggcttggcttagtcgaa24<210>23<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-f1<400>23gcacaatttggatcattaaaaggt24<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-r2<400>24gtcgtatccgcatccgtcaa20<210>25<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-p1<400>25cccagctattgcacatggtgttgat25<210>26<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-p2<400>26tgtacggctccgttgtggcggt22<210>27<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-2<220><221>misc_feature<222>(23)<223>n是脱氧肌苷<400>27ggttctcaagcaacaatatcagnt24<210>28<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-3<220><221>misc_feature<222>(22)<223>n是脱氧肌苷<400>28ggttctcaagcaacaatatcanct24<210>29<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-4<220><221>misc_feature<222>(21)<223>n是脱氧肌苷<400>29ggttctcaagcaacaatatcngct24<210>30<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-5<220><221>misc_feature<222>(20)<223>n是脱氧肌苷<400>30ggttctcaagcaacaatatnagct24<210>31<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-6<220><221>misc_feature<222>(19)<223>n是脱氧肌苷<400>31ggttctcaagcaacaatancagct24<210>32<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-7<220><221>misc_feature<222>(18)<223>n是脱氧肌苷<400>32ggttctcaagcaacaatntcagct24<210>33<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:up-ir-8<220><221>misc_feature<222>(17)<223>n是脱氧肌苷<400>33ggttctcaagcaacaanatcagct24<210>34<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-2<220><221>misc_feature<222>(20)<223>n是脱氧肌苷<400>34gcggacagttgtttttcgant21<210>35<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-3<220><221>misc_feature<222>(19)<223>n是脱氧肌苷<400>35gcggacagttgtttttcgnct21<210>36<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-4<220><221>misc_feature<222>(18)<223>n是脱氧肌苷<400>36gcggacagttgtttttcnact21<210>37<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-5<220><221>misc_feature<222>(17)<223>n是脱氧肌苷<400>37gcggacagttgtttttngact21<210>38<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-6<220><221>misc_feature<222>(16)<223>n是脱氧肌苷<400>38gcggacagttgttttncgact21<210>39<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-7<220><221>misc_feature<222>(15)<223>n是脱氧肌苷<400>39gcggacagttgtttntcgact21<210>40<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-if-8<220><221>misc_feature<222>(14)<223>n是脱氧肌苷<400>40gcggacagttgttnttcgact21<210>41<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:uu-f1<400>41gcatatgatgaagcacacaacaaaatgg28<210>42<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:uu-r1<400>42gctttggctgatgattgcgtag22<210>43<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:mg-f1<400>43aaaacccacggaaatgatgaga22<210>44<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:mg-r1<400>44ctcgttaatttacctattccattttg26<210>45<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-f1<400>45tacgcctgctactttcacgc20<210>46<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ng-r1<400>46caatggatcggtatcactcgc21<210>47<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ct-f1<400>47ttattcatccgaatggataaagcgtga27<210>48<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:ct-r1<400>48aacaatgaatcctgagcaaagg22<210>49<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸:uu-f2<220><221>misc_feature<222>(26)<223>n是脱氧肌苷<400>49gcatatgatgaagcacacaacaaaangg28<210>50<211>22<212>dna<213>人工序列<220><22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