本发明涉及一种植物突变体库构建方法，具体是利用一种经过改造后可控诱导表达且再转座能力缺失的Tnt1反转录转座子构建植物突变体库的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
随着植物分子生物学技术的不断发展, 突变体的应用也越来越广泛。目前, 构建植物突变体库的主要方法包括体细胞无性系变异、物理诱变、化学诱变和生物诱变, 这4种诱变方法的机制和特征各不相同(Larkin and Scowcroft, 1981; 李晓玲等,2008; 牛艳丽等, 2009; 郭建秋等, 2010; 徐明和路铁刚, 2011; 樊双虎等, 2014); 其中, 生物诱变目前应用较多。
生物诱变主要指外源片段插入引起的突变, 现阶段常用的生物诱变方法主要包括T-DNA插入、转座子插入和反转录转座子插入三类。转座子可以在基因中移动，其转座机制类似于“剪切-粘贴”，目前已经有人发明出基于Ac-Ds转座子的诱导表达突变体系，但受限于在转座过程中会切除已经产生的插入，故会影响原有的突变，不能产稳定突变。反转录转座子转座机制类似于“复制-粘贴”，即在转座过程中不切除已经产生的插入, 对原有的突变不产生影响, 所以能够产生稳定的突变体。
Ac-Ds转座子在发生跳跃后插入到基因组中的另外一个位点，然而，不同的植物中，转座行为也有很大的差别。Ac转座子倾向于插入与起始位点连锁的位置，Ac/Ds标签系统中Ac转座子伴随供体位点遗传的频率在不同的植物中也不相同，玉米中为42%，烟草为58%，拟南芥为53%。研究表明，Ac偏好插入到低甲基化、低拷贝或单拷贝序列的位点，Ds偏好插入在供体位点附近。Ac/Ds 转座子系统也能够造成主要染色体重排(Major chromosomal rearrangements，MCRs)。同时，AC-DS在切离过程中，有可能会残留或携带走部分序列，影响氨基酸编码，从而造成突变，然而此类突变由于没有标签，是难以寻找和鉴定的。
烟草Tnt1反转录转座子（GenBank登陆号X13777.1）是一种植物体内的转座子。Tnt1全称为 transposable element of Nicotiana tabacum，最早是由Grandbastien等(1989)在烟草中首次发现并命名的。Tnt1属于长末端重复(long terminal repeat, LTR)型反转录转座子，全长5,334bp，其中两端包含2个610bp的末端重复序列和1个3,984bp的开放阅读框。开放阅读框编码1个含有Tnt1且为RNA介导的反转录过程所必需的多蛋白复合体，该多蛋白复合体包含1个gag核心蛋白、1个反转录酶、1个核酸内切酶和1个蛋白酶。
Tnt1被确定在组织培养过程中发生转录和再转座的特性，同时在植物有性繁殖过程中能稳定遗传和形状分离，从而可以被用来建立突变体库。在部分作物中，Tnt1被发现倾向于插入植物基因组的外显子中(Mazier et al., 2007, Tadege et al., 2008)，同时，也有研究表明，相比于别的反转录转座子，Tnt1无明显的插入位点特异性，并没有任何1个染色体区域具有特别多或者特别少的Tnt1插入(Courtial et al., 2001，Tadege et al., 2008)。
现有技术利用Tnt1在组织培养过程中再转录的特性，以最初含有Tnt1插入的植株作为原始材料，对植物外植体进行组织培养，不断诱导新植株再生。为了避免插入位点的重复，每个愈伤组织所分化的多个再生植株中只选择1个植株。
Tnt1在某些自然条件下仍然会发生再次转座，比如胁迫环境或者对抗植物病原体时期（Grandbastien 1998）。无意义的不可控转座会导致增加新的插入突变位点，给后续的科学研究和生产应用造成难以判断的结果。
技术实现要素：
现有的Ac-Ds诱导表达转座体系，由于对插入位点有偏好性，制造突变体库过程中易产生同样区域附近的突变，提高突变体库基因覆盖度难度大；在再转座过程中，可能出现碱基的缺失或者残留，产生无法鉴定的点突变，尤其对于没有参考基因组的物种，这类突变会严重干扰后续应用。为了解决此类问题，我们采用了Tnt1转座子，Tnt1无明显的插入位点特异性，适合快速制造高覆盖度的突变体库；Tnt1插入后也不会再次改变序列，制造的突变体用简单方法即可鉴定突变基因。
现有技术中Tnt1的再转座活性在组织培养过程中可被激活，并在再生植株中又产生新的插入，对含有Tnt1插入的蒺藜苜蓿、拟南芥和大豆株系分别进行组织培养，统计再生植株中新增的Tnt1插入分别为6–59个、0–26个和平均8个。由于导致突变表型的目标基因往往只有1个，所以需要进行多次筛选和验证才能确定引起突变表型的目标基因，因而限制了正向遗传筛选的效率。为了解决此类问题，本技术通过控制诱导表达物浓度，可以人工控制Tnt1激活活性，从而控制新的插入数量在所需范围内。
由于构建突变体库的群体较大，需要不断对含有Tnt1的原始材料进行大量组织培养；同时，在鉴定插入目的基因与突变体表型的连锁关系时，还需要吃饭进行有性繁殖，产生表型和纯合度都有分离的后代群体，所以利用Tnt1构建突变体库的植物必须同时具备成熟的组织培养和有性繁殖的技术体系。为了解决此类问题，本技术利用诱导表达启动子实现TNT1转座子的激活，仅需要对母本植株施加诱导物质，就可以激活Tnt1的再转座活性，避免了构建突变体库过程中的组培工作，减少了工作量和实验时间，降低了工作难度和成本，提高了突变体库构建和后期实验效率。
现有技术中，Tnt1的转座能力依赖于组培激活，在转座过程中，会将后一部分重复序列复制至前一部分，复制后的全部序列与原始序列一致，仍然具有转座能力。然而部分植物的基因功能回补依赖于组培，在此过程中，会激活Tnt1转座子，产生新的插入位点，造成新的突变并对功能回补和后续工作产生干扰。为了解决此类问题，本技术通过对后一部分重复序列的修改，使得转座后复制得到的LTR序列与原序列不一致，失去转录结合位点，在组培条件下也无法被激活，彻底失去转座能力，同时避免了包括组培在内的产生任何新转座插入的可能性。
现有技术在构建突变体库时使用的组培方法属于无性繁殖方法，在操作过程中仅会产生新的突变，无法去除原有序列。然而在后续实验中，通常希望去掉构建突变体库时携带的抗性筛选标记，有时甚至是必须的，这就需要在后续实验中重复进行有性繁殖，增加实验时长。为了解决此类问题，本技术可以同步或分步进行突变体库构建和基因去除工作，有极大可能性同步除去建库时使用的T-DNA序列，从而除去建库过程中导入的抗性筛选标记和全部有转座能力的片段，彻底排除干扰，同时减少工作时长，解决突变体植株带有建库带有筛选抗性的问题。
具体实施方式
构建一种诱导表达的的Tnt1反转录转座子载体，去掉烟草Tnt1反转录转座子序列第一个重复区域中间AAGCTTTGGCTATAAAAGGAGAGC序列中TATA四个碱基之前的序列，并将其与诱导表达启动子中的TATA序列融合。
进一步修改Tnt1反转录转座子序列，将烟草Tnt1反转录转座子序列第二个重复区域中间AAGCTTTGGCTATAAAAGGAGAGC序列中TATA四个碱基突变为CATA、CACA等任何与原有碱基不同的结果，并避免在+-20bp范围内出现TATAWAW序列。
通过针对不同植物特异的转基因方法，将DNA片段转入植物基因组，筛选获得基因组中含有设计序列的植株。
使用插入T-DNA特异引物和简并引物对上一步获得的转基因植株的基因组DNA进行两轮TAIL-PCR，通过克隆测序的方法得到突变体中Tnt1的具体插入位点，并确认为单拷贝。筛选确认的植株得到的植株被称为突变体库母本。突变体库母本可以在正常培养环境下不断扩繁（扩繁得到的种子中，合格突变体库母本的比率为50%）。
对生长过程中突变体库母本施加诱导物质，激活Tnt1转座子，使基因组上产生新的转座插入位点。收获种子之后即获得突变体库，可以对其进行表型筛选和进一步研究。施加诱导物质后产生的新个体被称为突变体。
提取突变株系的基因组DNA，使用Tnt1特异引物和简并引物对突变体的基因组DNA进行两轮TAIL-PCR扩增，然后通过克隆测序的方法得到突变体中Tnt1的具体插入位点和突变的基因。同时进行PCR检测，鉴别得到不含有原始T-DNA插入的突变体（占获得种子的比率为25%）。
将所需要的突变体和野生型杂交，对子代进行PCR检测，分离得到含有目的突变，不含有原始T-DNA插入的突变体。
上述具体实施方式仅是本发明的基本原理和主要特征进行描述，并非是对本发明的范围进行限定，凡是未脱离本发明技术精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的同等变化或改型，皆应落入本发明的专利保护范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 利用可控诱导表达且再转座缺失的Tnt1反座子构建植物突变体库
<141> 2018-01-11
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 5131
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 2
tataaaagga gagcttcaac tctcatttct tcacaccaac aaagagagaa agaaagagtg 60
aggtttcaca gacaaggtat aagaaaatag tctgtgagga aaatagagag tgagcgatat 120
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