一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法与流程

文档序号：15224306发布日期：2018-08-21 17:55阅读：279来源：国知局

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法。

背景技术：

体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆、疾病模型、人类器官移植、动物转基因研究、濒临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核未被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化，这些表观遗传修饰主要包括组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化和dna甲基化三方面。

尽管组蛋白甲基化等表观遗传修饰在动物胚胎发育中广泛存在，但是，目前尚未有研究从克隆胚胎和受精胚胎之间表观遗传修饰差异的角度，揭示表观遗传修饰与内源蛋白表达水平的关系，导致对于如何提高动物胚胎体外发育效率，仍缺乏明确且行之有效的解决策略，特别是利用kdm4家族基因差异表达提高牛体细胞克隆胚胎发育率、囊胚细胞数和出生率的作用尚未见到报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种体外转录模板载体，该载体包括用于表达目的序列的重组基因表达盒，所述目的序列包括kdm4e基因，该基因具有编码去组蛋白h3k9甲基化酶kdm4蛋白家族中严格保守的决定酶活性的关键位点序列。

优选的，所述目的序列还包括与所述kdm4e基因串联表达的绿色荧光蛋白egfp基因。

优选的，所述重组基因表达盒还包括位于所述目的序列上游的kozak序列。kozak序列是真核生物转录所得mrna上较为保守的序列，它可以促进mrna有效地与核糖体结合，保证翻译的正常进行。

优选的，所述kdm4e基因选自牛kdm4e基因读码框。

优选的，所述kdm4e基因如seq.id.no.1所示。

优选的，所述载体具体包括作为骨架的pcdna3.1(+)载体以及插入在pcdna3.1(+)载体多克隆位点区内的上述重组基因表达盒，该重组基因表达盒采用pcdna3.1(+)载体所含t7启动子启动目的序列表达，还包括依次排列于pcdna3.1(+)载体所含t7启动子之后的kozak序列、绿色荧光蛋白egfp基因读码框及牛kdm4e基因读码框。

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的牛体细胞克隆胚胎处理方法，该处理方法包括以下步骤：

经体外转录反应获得转录自目的序列的mrna，所述目的序列包括kdm4e基因，该基因具有编码去组蛋白h3k9甲基化酶kdm4蛋白家族中严格保守的决定酶活性的关键位点序列；再将所述mrna注入到完成融合及激活处理的牛体细胞克隆胚胎中，使该胚胎过量表达kdm4e蛋白。

优选的，所述mrna注入时间为牛体细胞克隆胚胎的合子激活期之前。

优选的，所述处理方法具体包括以下步骤：

1)目的序列的体外转录

在骨架载体中插入kdm4e基因、绿色荧光蛋白egfp基因以及位于前端的kozak序列；然后将所述载体经线性化处理后进行体外转录，得到用于融合表达kdm4e基因和绿色荧光蛋白egfp基因的稳定的mrna，将该mrna稀释至800～1200ng/μl；

2)基于体细胞核移植构建牛体细胞克隆胚胎

将经过诱导饥饿培养的牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，将供体细胞注入去核的牛卵母细胞中得到重构体，对重构体进行融合处理，对融合得到的牛体细胞克隆胚胎进行激活处理；

3)mrna注入及牛体细胞克隆胚胎培养

对经过激活处理的牛体细胞克隆胚胎进行恢复培养，然后将步骤1)所得mrna(其中，kdm4emrna有效浓度为500～750ng/μl)按照8～10pl的剂量通过显微注射注入所述牛体细胞克隆胚胎；将注入mrna的牛体细胞克隆胚胎持续培养至8细胞期或囊胚期。

优选的，所述步骤1)中，kdm4e基因选自牛kdm4e基因读码框(如seq.id.no.1所示)，以pcdna3.1(+)表达载体作为骨架载体；

所述步骤2)中，在对重构体进行电融合后1～1.5h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚胎进行以下激活处理：先在含5μmol/l离子霉素的msof溶液中于25℃孵育4min，然后在含2mmol/l6-dmap的msof溶液中培养4～4.5h；

所述msof溶液以sof溶液为基础培养液，还含有体积分数2％的bme、体积分数1％的mem、体积分数1％的its、1mmol/l的谷氨酰胺、80mg/ml的bsa、100iu/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素；

所述电融合包括以下步骤：将重构体于电融合液中预平衡3min；然后于供体细胞和去核卵母细胞膜接触面处施加电击1次，电击采用的电压为35v，脉冲时间为10μs；

所述步骤3)中，恢复培养包括以下步骤：将牛体细胞克隆胚胎经激活处理后转移到msof溶液中培养1.5～2h；显微注射时将牛体细胞克隆胚胎置于含体积分数10％fbs的m199培养液中；所述持续培养包括以下步骤：将18～20枚经显微注射处理的牛体细胞克隆胚胎继续在120～150μlmsof溶液中培养至72～96h，然后吸除60～75μl原培养液，补加同样体积的新鲜msof溶液，继续培养至第7～8d。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明构建了用于体外转录kdm4e基因mrna的载体，所得mrna注入牛体细胞克隆胚胎中后可翻译出有组蛋白去甲基化酶活性的kdm4e蛋白，可有效减弱牛体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰水平。结果显示，本发明能显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可体外高效生产牛体细胞克隆胚胎，可应用于提高牛克隆效率。

进一步的，本发明注入牛体细胞克隆胚胎的mrna可以融合表达绿色荧光蛋白egfp基因和kdm4e基因，在显微注射后可用于快速筛选组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰水平减弱的牛体细胞克隆胚胎。

进一步的，本发明基于“牛体细胞克隆胚胎在8细胞时期相较体外受精胚胎kdm4e基因具有显著异常低的表达水平”的发现，表达的kdm4e基因源自牛，既方便开展体外生产牛体细胞克隆胚胎，也有利于实现稳定、安全、高效的体外生产牛体细胞克隆胚胎。

进一步的，本发明表达的对象为牛kdm4e基因的完整读码框，与注射功能缺失突变型mrna的对照组和未注射组相比，注射一定剂量和浓度的野生型kdm4e基因mrna可在牛体细胞克隆胚胎的合子激活前期成功表达具有活性的kdm4e蛋白，从而有效减弱体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰水平。

进一步的，本发明构建的载体具有kozak序列，可促进mrna注入后的稳定翻译，提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，有利于体外高效生产牛体细胞克隆胚胎。

进一步的，本发明采用的pcdna3.1(+)载体含有t7启动子，适用于体外转录大量mrna。

附图说明

图1为牛体细胞克隆胚胎和体外受精胚胎在胚胎各时期的组蛋白h3k9me3(红色)和h3k9me2(绿色)表观遗传修饰水平，白色为dapi染色的细胞核。

图2为牛体细胞克隆胚胎和体外受精胚胎在8细胞时期的kdm4家族基因表达水平。

图3为体外转录kdm4e基因野生型和功能缺失突变型mrna的载体构建流程示意图(展示了kdm4e的读码框、egfp标签，kozak序列等表达元件和pcdna3.1(+)多克隆位点的排列关系)。

图4为牛体细胞克隆胚胎显微注射kdm4e基因mrna后的实时荧光定量pcr结果。

图5为8细胞时期牛体细胞克隆胚胎内kdm4e过量表达效果图。

图6为经显微注射kdm4e基因mrna处理后的牛体细胞克隆囊胚的显微视图。

图7为囊胚期牛体细胞克隆胚胎的kdm4e(野生型)过量表达与对照组(突变型)和未注射组相比的细胞数显微分析结果，其中：cdx2是囊胚中滋养层细胞的特异表达蛋白。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

通过免疫荧光染色技术，发现牛体细胞克隆胚胎在合子激活早期(8细胞时期)具有异常高水平的组蛋白h3赖氨酸k9的3甲基化(h3k9me3)和2甲基化(h3k9me2)，且图1结果显示，牛体细胞克隆胚胎在8细胞时期相较体外受精胚胎，具有异常高水平的组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰。另外，通过实时荧光定量pcr，确定牛体细胞克隆胚胎这一异常高水平的组蛋白甲基化与其自身异常低表达水平的kdm4e基因有关(图2结果显示牛体细胞克隆胚胎在8细胞时期相较体外受精胚胎kdm4a、kdm4b、kdm4c等基因均无显著表达差异且表达量极低，kdm4d和kdm4e基因均具有显著异常低表达水平，但kdm4d表达丰度没有kdm4e基因高，基因定量pcr检测引物序列详见表1)，最终确定kdm4e起主要的去甲基化作用。kdm4e基因所表达的蛋白为专一性去除组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰的去甲基化酶。由此，鉴定出导致牛体细胞克隆胚胎克隆效率低下的内源缺陷表达因子kdm4e。根据以上发现，在体细胞克隆胚胎合子激活时期之前人为过量表达kdm4e蛋白，有效减弱体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰水平，改善牛体细胞克隆胚胎的内源性重编程障碍，达到促进体细胞克隆胚胎正常发育的目的。

据此，本发明提供了基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚胎的处理方法，将牛体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合和激活之后，也就是在重构体构建完成后1.5～2h，对牛体细胞克隆胚胎采用显微注射技术注入牛kdm4e基因的mrna，使牛体细胞克隆胚胎过量表达牛kdm4e蛋白，纠正牛体细胞克隆胚胎异常高水平的组蛋白甲基化，以改善牛体细胞克隆囊胚质量和发育率，并提高克隆牛出生率。具体说明如下：

(一)试剂、培养液和处理液的来源或制备方法

dmem/f12液体培养基、pbs、te缓冲液、特级胎牛血清(fbs)、m199培养液(包括含hepes的培养液产品以及不含hepes的培养液产品)、bme和mem为gibco产品。h3k9me3和h3k9me2的抗体购自abcam公司，货号分别为ab8898和ab1220；cdx2抗体购自biogenex公司，货号为am392。its采用thermo公司产品its-g(即亚硒酸钠溶解的its，its-g包含有两种蛋白：胰岛素和转铁蛋白)。离子霉素、6-dmap、透明质酸酶、细胞松弛素b、hoechst33342、dapi、石蜡油和其他未标明的试剂均为sigma公司产品。

a、卵母细胞体外成熟培养液

上述成熟培养液为不含hepes的m199培养液中添加2.2mg/mlnahco3、0.075iu/mlhmg(人绝经尿促性素)、1μg/ml17β-e2、0.33mm丙酮酸钠、2mml-谷氨酰胺以及100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

b、msof溶液

msof溶液是以sof培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的bme、体积分数1％的mem、体积分数1％的its、1mmol/l的谷氨酰胺、80mg/ml的bsa、100iu/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素；

sof溶液制备：将0.6294g的nacl、0.0534g的kcl、0.162g的kh2po4、0.0172g的cacl2·2h2o、0.00996g的mgcl2·6h2o、0.2106g的nahco3、0.0033g的丙酮酸钠，及28.24μl的乳酸钠加入98ml水中，1mmnaoh调ph到7.2～7.4，去离子水定容到100ml。

c、电融合液

电融合液的组成为：0.3mol/l甘露醇、0.05mol/l氯化钙、0.1mol/l硫酸镁、0.27mol/l组氨酸，及0.1％bsa。

d、dmem细胞培养液的配制

成品dmem/f12液体培养基加入10％fbs，及10ng/mlbfgf，以此为细胞完全培养液。成品dmem/f12液体培养基加入0.5％fbs，及10ng/mlbfgf，以此为细胞饥饿培养液。

(二)体外获得大量牛kdm4e基因野生型mrna和功能缺失突变型mrna

牛kdm4e基因位于15号染色体上，编码序列长1284bp，编码氨基酸427个。参见图3，使用invitrogen公司的trizol提取牛睾丸组织(采自陕西省西安市三桥和灞桥定点屠宰场，采集时间：2014年4月)rna后，通过反转录pcr获得相应cdna，以此为模板使用takara公司的高保真pcr酶primerstar，通过常规pcr获得野生型kdm4e基因的读码框全长。随后拼接入clontech公司pegfp-c1载体多克隆位点区域内的hindiii和bamhi酶切位点，以此获得含kozak序列和绿色荧光蛋白egfp标签的kdm4e基因串联表达结构。测序正确、无突变的序列再经nhei和bamhi酶切，连入invitrogen公司pcdna3.1(+)载体的多克隆位点区域中，获得最终可以作为体外转录模板的载体。功能缺失突变型kdm4e基因的读码框全长是使用带定点突变位点的引物，通过重叠延伸pcr获得，随后的模板载体构建流程方法与野生型一致。

扩增野生型kdm4e基因的引物(使扩增产物两端添加hindiii和bamhi酶切位点)为：上游5’-cctcaagcttctatgcaggctaagc-3’；下游5’-gctcggatcctcatatctgagtctt-3’。扩增突变型kdm4e基因的定点突变引物为：上游5’-gcaggaggacatggacctttatag-3’；下游5’-tgctgccaggcgaaggcggtcttc-3’。

扩增得到的kdm4e基因读码框核酸序列(seq.id.no.1、seq.id.no.2)为：

5’-atgcaggctaagcactttggttcccagaacccaagttgtaagatcatgaccttccacccaactatggaagaatatgcggatttcaacaaatacattgcttacatagaatcgcaaggggcccaccgagcaggcttggctaagatagtgccacccaaggaatggaaagccagacagacctacgacgatatcgatgacatcttaatagccgctccgctccagcaggtggtctctgggcgggcaggtgtgtttactcaataccacaaaaagaagaaagccatgaccgtggcagagtaccgccacttagcaaatactgaaaaataccagactccattctactccgattttgaggaattggagcgaaaatattggaaaacccgcctctttgagtccccaatatacggcgcggacatcagtggctctttatttgatgaaaacacgaagcagtggaacctgggacgcctggggaccatccaggacctgctggagcaggagtgcggggtggtcatcgagggcgtcaacaccccctacctgtacttcggcatgtggaagaccgccttcgcctggcacac(gca)ggaggacatggacctttatagcatcaacttcctgcacttcggggagcccaagacctggtacgcggtgccacccgagcacggccggcgcctggaacgcctggccggcgcgctcttcccgggcagctcgaggggctgcgaggccttcctgcgccacaaggcggcgctcatctcgcccacggtgctccgggacaacggcatccccttcggtcgggtcacgcaggaggcgggcgagttcatggtgaccttcccctacggctaccactcgggcttcaaccacggcttcaactgcgccgaggccatcaatttcgccaccccgcgctggatcgattatggcaaagtggcctcgcagtgcagctgcggcgaggcgcaggtggccttctccatggacgccttcgtgcgcatcctgcagcccgagcgctatgagctgtggaagcgcgggcaggaccgggcggtggtgaaccacgccgagcccgcggcgccgggcggccaggagctgagtgcctggagggaggtgcactcgccctggggaacccggctcgcctgcaattcccaggagccgcgccagaccccgccgcggacgccaggtccatctcctccagatcaccacccaactggcagatgtgtttctcgtcgtcgtcgtcctcggaaaaggggtactccagagctgactgtccgacccgggcgaagaggagcctctccaaagactcagatatga-3’

以上序列中，下划线显示功能缺失突变型kdm4e基因的突变位点，括号内显示突变后的序列结果。

扩增野生型kdm4e的读码框是为了获得能正确表达kdm4e蛋白的核酸序列，将其插入含t7启动子的表达载体内，即可使用体外转录试剂盒依照读码框核酸序列高效转录出相应mrna，随后注入牛体细胞克隆胚胎才能翻译出正确的肽链，并组装成有活性的kdm4e蛋白。合成功能缺失突变型基因的目的在于作为无去组蛋白甲基化酶活性的对照组样品，消除显微注射实验对牛体细胞克隆胚胎发育的影响。kozak序列为gccacc，为pegfp-c1载体自带元件，加在读码框序列atg的前端，促进转录出的mrna有效地与核糖体结合，保证翻译的正常进行。向kdm4e蛋白融合表达egfp标签，便于直观检测靶基因注射的翻译效果，并跟踪靶基因的亚细胞定位。

所构载体随后使用neb公司的pcii限制性内切酶进行过夜酶切线性化(图3)，随后经1％琼脂糖凝胶电泳(120v)30min。充分切开的样品使用axygen公司的axyprepdna凝胶回收试剂盒进行胶回收获得模板。接下来使用ambion公司的mrna体外转录试剂盒mmessagemmachinet7ultrakit，通过加帽转录过程和poly(a)加尾反应，获得大量包含牛kdm4e基因转录产物的mrna，并再由qiagen公司的rna提取试剂盒rneasyminikit对产物进行纯化。最后使用无rnase的三蒸水稀释mrna至800ng/μl，其中kdm4emrna有效浓度为500ng/μl，用于随后牛体细胞克隆胚胎的显微注射操作。

(三)体细胞核移植技术生产牛体细胞克隆胚胎的制备和处理过程

a.供体牛胎儿成纤维细胞的制备

从液氮罐中取5代以内的牛胎儿成纤维细胞(采集自杨凌科元克隆股份有限公司牛场，采集时间：2014年1月至2016年3月)于38℃解冻，加1ml的dmem细胞完全培养液混匀后1000rpm离心5min。弃上清，加4ml新的细胞完全培养液重悬细胞，并接种于60mm的细胞培养皿中，置于38.5℃，5％co2培养箱中培养，翌日换液。待牛胎儿成纤维细胞达到90％汇合程度时，吸弃培养液，用pbs冲洗细胞，加入te缓冲液消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用新的dmem细胞完全培养液终止消化，用移液器吹打后离心并悬浮，均匀接种于24孔板中，再次放入培养箱中培养。翌日将供体细胞的培养液替换为细胞饥饿培养液，48h后可诱导细胞停滞于g0/g1细胞周期，即为合适的供体细胞。

b.卵母细胞的成熟培养

牛卵巢采自陕西省西安市三桥和灞桥定点屠宰场(采集时间：2014年1月至2016年3月)，将卵巢浸于含青、链霉素的生理盐水保温瓶中，水温20～25℃，5h以内运回实验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面多余的结缔组织，在无菌生理盐水中清洗血渍。用装有12g针头的10ml注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡的卵泡液，随后将液体打入60mm细胞培养皿中，在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cocs)。收集的cocs在含5～15％fbs的pbs中清洗三遍，并选择形态正常的a、b级卵母细胞用于体外成熟培养。a级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；b级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。合格的cocs在卵母细胞体外成熟培养液中洗两遍，然后移入装有4ml预热的上述成熟培养液的35mm培养皿中，在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养20～24h。将培养成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的无ca²⁺、mg²⁺pbs中消化1～2min，并用移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外黏附的卵丘细胞。吹打干净后，在pbs中洗3次，再在实体视显微镜下用玻璃针拨动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞待用。

c.牛体细胞克隆胚胎的构建

去核：去核前卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素b、10μg/mlhoechst33342和体积浓度10％fbs的m199培养液中孵育15min；然后在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质以检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞可用于核移植。

注供体细胞和电融合：挑选直径为15～20μm待移植的牛体细胞(供体细胞)，注入到去核卵母细胞的透明带下。注核后的重构体采用微电极的方法进行融合。在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min。用于融合操作的两根z字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，将重构体的供体细胞和去核卵母细胞膜接触面与两电极呈一条线夹住，融合参数为：电压为35v，脉冲时间为10μs，电击一次。融合后1h在显微镜下观察融合情况，将未成功融合的重构体吸弃，成功融合的重构体即牛体细胞克隆胚胎(1细胞期)。

d、牛体细胞克隆胚胎的激活

在电融合后1～1.5h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚胎(1细胞期)依次进行以下激活处理：含5μmol/l离子霉素的msof溶液中25℃孵育4min，随后在含2mmol/l6-dmap的msof溶液中，在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养4h。牛体细胞克隆胚胎在进行激活处理后，转移到msof溶液(每120～150μlmsof液滴含18～20个胚胎)中，在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养1.5～2h(恢复培养)后，进行显微注射操作。

e、牛体细胞克隆胚胎的显微注射

将在msof溶液中恢复培养1.5～2h的牛体细胞克隆胚胎转移到预热的体积分数为10％fbs的含hepesm199培养液液滴中。置于配备eppendorf公司显微操作臂transfermannk2和显微注射气泵femtojet的倒置显微镜上。显微注射玻璃针为eppendorf公司的femtotipii型号产品，通过eppendorf公司的microloader将前面制备的800ng/μlmrna(含500ng/μl牛野生型kdm4e基因mrna或牛kdm4e基因的功能缺失突变型mrna)注入针尖处。每个胚胎大约注射10pl的mrna，以胚胎胞质发生扩散性稀释为成功注入的标准。

f、牛体细胞克隆胚胎的培养及相关检测项目

经显微注射处理的牛体细胞克隆胚胎继续在msof溶液(每120～150μlmsof液滴含18～20个胚胎，作为培养基的msof溶液上还覆盖有石蜡油，并预先在co2培养箱中平衡至少2h)中38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养至72h(0h为胚胎激活后转入msof的时刻)，然后吸除60～75μl原培养液，补加同样体积的新鲜msof溶液，继续在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养至第7d。这期间对卵裂率、8细胞胚胎发育率和囊胚发育率作相关统计(表3)，利用本发明的处理方法制备的牛体细胞克隆囊胚的显微视图如图6。随后囊胚被注入同期发情的红安格斯受体牛的子宫角，以检测最终克隆牛的出生效率(表5)。此外，对处理过程中所得的2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚，及囊胚进行裂解和反转录pcr，通过实时荧光定量pcr，判断牛野生型kdm4e基因mrna的注入情况和表达模式(图4)。涉及的定量pcr检测引物序列详见表1。最后，收集处理所得的牛体细胞克隆8细胞胚胎和囊胚，通过免疫荧光染色技术，判断利用本发明的处理方法制备的牛体细胞克隆胚胎在8细胞周期的h3k9me3或h3k9me2的表观遗传修饰情况(表2，图5)，以及对最终发育的囊胚进行细胞数检测(表4，图7)。

表1.实时荧光定量pcr引物序列

(四)检测结果

本发明的处理方法可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可体外高效生产牛体细胞克隆胚胎，并提高克隆牛的生产效率。具体表现为：

1)牛体细胞克隆胚胎中kdm4e的过量表达效果以及h3k9me3和h3k9me2的表观遗传修饰水平变化

向牛体细胞克隆胚胎注射牛野生型kdm4e基因mrna(处理组)以及其功能缺失突变型mrna(对照组)，使胚胎过量表达携有egfp标签的野生型kdm4e蛋白或表达其功能缺失突变型蛋白。首先对处理所得的2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚，及囊胚进行裂解和反转录pcr，通过实时荧光定量pcr，判断牛野生型kdm4e基因mrna的注入情况和表达模式。结果显示，kdm4e基因mrna高水平存在于牛体细胞克隆胚胎2到8细胞期时段内，显著高于未注射的牛体细胞克隆胚胎，之后桑椹胚和囊胚时期该mrna下调主要是由于mrna的翻译后降解机制的发生(图4)。

此外，72h后收集处理组、对照组和未注射组的8细胞期胚胎，免疫荧光染色检测胚胎h3k9me3和h3k9me2的表观遗传修饰水平。如图5所示，白色为dapi染色的细胞核(第一行)，红色为胚胎h3k9me3或h3k9me2的免疫染色(第二行)，绿色为胚胎表达携有绿色荧光蛋白egfp的kdm4e蛋白(第三行)。结果显示，10pl800ng/μl的mrna显微注射量足够在体细胞克隆胚胎内表达kdm4e，且相应的去组蛋白h3k9me3和h3k9me2功能未受影响，说明kdm4e的过量表达效果正常。未注射或注射功能缺失突变型的kdm4e的mrna均无法去除8细胞时期牛体细胞克隆胚胎内的组蛋白h3k9me3和h3k9me2。如表2所示，kdm4e在牛体细胞克隆胚胎的h3k9me3和h3k9me2表观修饰的去除效率分别为h3k9me3：95.0±4.6％vs37.1±6.8％和35.8±4.8％；h3k9me2：91.4±5.5％vs28.9±10.4％和32.1±4.7％(p<0.05)。

表2.过量表达kdm4e对牛体细胞克隆胚胎h3k9me3和h3k9me2表观修饰去除的影响

注：每组实验都重复五次。h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰的去除效率(mean±sd％)。在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(p<0.05)。

根据图5以及表2，对照组中功能缺失突变型的kdm4e的过量表达不仅无法去除8细胞时期牛体细胞克隆胚胎内的组蛋白h3k9me3和h3k9me2，而且与未注射组的组蛋白甲基化异常胚胎比例存在一定差异(尽管不显著)，表明了采用本发明处理方法时完整表达kdm4e蛋白的重要性。

2)牛体细胞克隆囊胚的发育率

如表3和图6所示，过量表达kdm4e对牛体细胞克隆胚胎发育的影响包括：处理组囊胚的发育率显著提高约15～20％，为48.6±5.1％vs27.3±4.8％和30.7±3.5％(p<0.05)。结果显示与对照组和未注射组相比，注射牛野生型kdm4e基因的mrna可以显著提高牛克隆囊胚的发育率。

表3.过量表达kdm4e对牛体细胞克隆胚胎发育率的影响

注：每组实验都重复五次。括号内的数据为发育率(mean±sd％)。2细胞胚胎、8细胞胚胎和囊胚的发育率分别在重组胚培养36h、72h和7d检测(0h代表胚胎激活后转入msof的时刻)。在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(p<0.05)。

3)牛体细胞克隆囊胚细胞数的检测结果

如图7所示，蓝色(第三行)和白色(第一行)为dapi染色的细胞核，表示囊胚细胞总数；红色为滋养层细胞的免疫染色(cdx2标签抗体，第二行)；合成图(合图)为差异染色显示结果，粉红色为滋养层细胞，蓝色为内细胞团细胞(第三行)。结果显示与对照组和未注射组相比，注射牛野生型kdm4e基因的mrna可以显著提高牛克隆囊胚内的内细胞团细胞数。由表4也可以看出，本发明的处理方法得到的囊胚其细胞总数显著高于对照组(131.9±39.2vs110.8±27.1，p<0.05)，与未注射组没有显著差异；此处理方法得到的囊胚其内细胞团细胞数显著高于对照组和未注射组(34.1±15.0vs21.0±11.9和26.2±12.5，p<0.05)；此处理方法得到的囊胚其内细胞团细胞数比值显著高于对照组和未注射组(34.6±12.7％vs23.6±12.0％和27.9±9.3％，p<0.05)。

表4.过量表达kdm4e对牛体细胞克隆胚胎细胞数的影响

注：每组样品均为重复实验的所有结果汇总(mean±sd)。在同一栏内数据上标不同表示差异显著(p<0.05)。

4)牛体细胞克隆囊胚的出生率

如表5所示，基于过量表达kdm4e降低胚胎组蛋白甲基化h3k9me3和h3k9me2水平的处理方法，可显著提高克隆动物的出生率。此处理方法得到的囊胚的体内发育能力显著高于对照组和未注射组(23.6±4.2％vs12.1±7.6％和7.0±6.8％，p<0.05)。

表5.过量表达kdm4e对牛体细胞克隆动物出生率的影响

注：第7d囊胚随后注入同期发情的红安格斯受体牛的子宫角，每头受体牛移植1枚胚胎。每组样品均为重复五次的实验结果汇总(mean±sd％)。在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(p<0.05)。

通过实验证明：与注射牛kdm4e基因的功能缺失型突变体mrna的对照组和未注射组相比，注射牛野生型kdm4e基因的mrna可以显著降低体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰水平(图5，表2)(p<0.05)，可以显著提高囊胚的发育率(图6，表3)、囊胚内的内细胞团细胞数，及囊胚内的icm:te比值(图7，表4)(p<0.05)。此外，胚胎移植后克隆牛的出生率也显著提高(表5)。

本发明中，首先根据图1、图2确定了kdm4e在胚胎8细胞时期去除h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰的过程中起主要作用，认定kdm4e为牛体细胞克隆胚胎中内源缺陷表达的因子，并通过体外转录获得其mrna，对牛体细胞克隆胚胎进行人为补偿表达kdm4e。选取kdm4e是因为kdm4e是一个牛体细胞克隆胚胎中内源缺陷表达的因子，而家族内其他蛋白不是，可以认为在牛体细胞克隆胚胎中过表达kdm4e更符合胚胎内原有的基因表达模式。成功的牛胚胎显微注射需要观测出胚胎胞膜略微膨胀，胞质略微稀释的现象。注射剂量一般为8～10pl，注入的mrna溶液的浓度超过1200ng/μl容易造成显微注射针堵塞，在800ng/μl以下则会对去甲基化效果有影响。不含kozak序列的mrna，会导致kdm4e蛋白翻译表达量降低，从而影响kdm4e在胚胎内发挥足够的去除h3k9me3和h3k9me2修饰功能，最终影响实验结果。

总之，过量表达牛kdm4e蛋白，可有效减弱牛体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白h3k9me3和h3k9me2表观遗传修饰水平，从而显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可体外高效生产牛体细胞克隆胚胎，并提高胚胎移植后克隆牛的出生率。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

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