本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种用于两个不同目的蛋白质表达和互作的多功能植物双元质粒(pPBEL-BiFC)的构建方法及其应用。
背景技术：
本质粒的基本骨架是基于pCambia1302载体，但pCambia1302只能做单个基因的表达，无HA,MYC标签，不能使用通用的标签序列进行Western blot分析。新构建的载体具有同时表达分别带有HA和Myc标签的两个不同的外源蛋白并分别与YFPN173和YFPC155同框(in-frame)表达融合蛋白，原有载体不能进行Co-IP免疫共沉淀反应，不能进行双分子荧光互补(BiFC)试验，重新分布、增加和排列了多克隆位点，两个多克隆位点区域(MCS)中每一个每个切点均是唯一的，每个多克隆位点区域(MCS1和MCS2)分别含有一个平末端酶切点SmaI和PmlI。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决原有的pCambia1302载体存在的缺陷，为了高效率进行植物蛋白质功能的研究，对只能做蛋白质在植物细胞定位的植物表达载体pCambia1302进行了系统改造，构建成新多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC，提供了一种新型的用于蛋白质表达和蛋白质互作的多功能植物载体。
其具体技术方案为：
多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法，包括以下步骤：
步骤1.消除了原有的多克隆位点MCS区，在另外部位即HA和Myc标签的后部引入两段新的MCS区域，可以有更多的酶切位点选择，方便在这两个标签之后插入目的基因。
步骤2.利用NcoI和BstEII双酶切消除原有的GFP基因和酶切点，引入HA标签序列，再紧随其后加上多克隆位点(MCS)和YFPC155序列。
步骤3.用XhoI切除Hygromycin抗性基因，加上Myc从标签序列，再紧随其后加上多克隆位点(MCS)和YFPN173序列。
本发明所述的多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。HA标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；多克隆位点1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；YFPN173的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；多克隆位点2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；YFPC155的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明新构建的质粒具有同时在植物细胞、原生质体、组织中表达两个不同融合蛋白质，以进行生物化学、生物物理学等方面的研究。
本发明所构建的多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC在研究蛋白质在体内(in vivo)互作，揭示蛋白质新功能等方面具有全新的应用价值。
本发明所述多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC在免疫共沉淀Co-IP和BiFC检测过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明改造后的质粒是2-in-1质粒，不同于普通的蛋白质互作实验需要将两个目的基因分别构建在两个不同质粒上，本发明新构建的新质粒可以大大简化实验程序，提高了科学研究工作效率，适用于所有可以做瞬时转化和农杆菌街道转的植物材料。用该质粒得到的产物本发明可以使用生物化学的方法(免疫共沉淀Co-IP)和生物物理方法(双分子荧光互补BiFC)研究两个未知蛋白之间的互作，亚细胞共定位；除蛋白质物理互作关系分析之外，构建的新质粒还可以方便做蛋白质激酶与底物磷酸化分析，蛋白质泛素连接酶与底物泛素化分析等。
附图说明
图1有代表性的BiFC分析图谱；
图2是利用pPBEL-BiFC质粒得到的BiFC结果，其中，图2(A)为野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H(细胞核定位)之间的互作和共定位(两蛋白互作于细胞核)，图2(B)为野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1(原生质膜定位)之间的互作和共定位(两蛋白互作于细胞质膜)；
图3是利用pPBEL-BiFC质粒得到的Co-IP结果，其中图3(A)为野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H免疫共沉淀结果，图3(B)为野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1免疫共沉淀结果。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
将YFP荧光蛋白质分成YFPN173和YFPC155两个片段，分别构建成了HA-PmlI-EcoRI-SpeI-HindIII-BamHI-NcoI-YFPN173-BstEII和Myc-SmaI-KpnI-SalI-PstI-BglII-XbaI-SacI-YFPC155-XhoI两个cassettes代替了原质粒上的GFP和Hygromycin基因，所构建的质粒能利用HA和Myc为蛋白质翻译起始并作为Western blot通用标签，使用生物化学免疫共沉淀(Co-IP)方法鉴定两个蛋白质之间的互作关系。同时还通过利用其后的YFPN173和YFPC155分裂片段能够进行双分子荧光互补分析，从而可以检测蛋白质互作关系在细胞中的动态过程和互作的强弱程度。
把原有载体上位于LacZ基因上的多克隆位点EcoRI-HindIII给消除掉了，将这些和新加的酶切位点分别分布于HA-MCS-YFPN173和Myc-MYC-YFPC155上，除了其它多个粘末端酶切点之外，在这个两个多克隆位点上分别布置了一个SmaI和PmlI平末端酶切点供作基因的通用插入或者重组插入。
通过该载体，在HA-MCS-YFPN173和Myc-MYC-YFPC155两个不同多克隆位点区域(MCS1和MCS2)上同框插入两个不同目的基因，可以使用原生质体的瞬时转化表达，或者通过农杆菌介导转化植物叶片或者通过发根农杆菌诱导植物(如大豆子叶)发根，使两个融合蛋白同时表达，利用所得材料进行蛋白质Co-IP和BiFC分析，用来检测两个蛋白互作和功能分析，以及蛋白激酶对底物的磷酸化或泛素化连接酶对底物的泛素化研究等等。
本发明成功利用所构建的质粒分析了两对基因之间的互作关系。
1.水稻水孔蛋白OSPIP1；1和野生大豆蛋白激酶GsSnRK1之间的互作；
2.野生大豆转录因子ERF71和野生大豆蛋白激酶GsSnRK1之间的互作。
如图2所示，利用pPBEL-BiFC质粒和双分子荧光互补(BiFC)方法研究了野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H在细胞核中的定位和互作；野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1在原生质膜定位上的互作和共定位。GsSnRK1同框(in-frame)插入位于Myc标签和YFPC155之间的SmaI位点，而GsERF71H和OsPIP1；1插入位于HA标签和YFPN173之间的PmlI位点。图2(A)和图2(B)两组图中的各小图说明(从左至右)：含有pPBEL-BiFC重组质粒的原生质体在白光下的影像；叶绿体自发光影像；黄色荧光蛋白(YFP)发光影像；白光和黄色荧光重叠影像。
如图3所示，利用pPBEL-BiFC质粒和免疫共沉淀(Co-IP)方法研究野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H(A)，野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1(B)之间的互作关系。图3(A)和图3(B)两组图中的各小图说明(从上排左至右和下排左至右)：总蛋白；用anti-Myc抗体做免疫沉淀，用anti-HA抗体做Western blot得到的共沉淀蛋白；总蛋白；用anti-HA抗体做免疫沉淀，用anti-Myc抗体做Western blot得到的共沉淀蛋白。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 黑龙江省东北农业大学
<120> 多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9566
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgtaccca tacgatgttc cagattacgc tcacgtgaat tcactagtaa gcttcggatc 60
catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga 120
cggcgacgtg aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta 180
cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac 240
cctcgtgacc accttcacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa 300
gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt 360
cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 420
ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca 480
caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa 540
cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag taaggtgacc tgtgaccagc 600
tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 660
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 720
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 780
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 840
gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt 900
ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa cggatattta aaagggcgtg 960
aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga 1020
tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt 1080
gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc 1140
cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg 1200
cgactagaac cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta 1260
tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc 1320
cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct 1380
ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg 1440
cctggcccgc agcacccgcg acctactgga cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc 1500
gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt 1560
gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg 1620
gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac 1680
cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga 1740
ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga 1800
ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga 1860
ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac 1920
caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg 1980
gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg 2040
gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc 2100
gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc 2160
gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta 2220
tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc 2280
gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg 2340
cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc 2400
cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag 2460
cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc 2520
cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc 2580
agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca 2640
aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc 2700
ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg 2760
ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa 2820
ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac 2880
gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc 2940
agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct 3000
gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc 3060
gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag 3120
gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg 3180
gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca 3240
ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa 3300
atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag 3360
cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga 3420
atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc 3480
aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat 3540
agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc 3600
gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc 3660
atggccagtg tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc 3720
atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt 3780
gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta 3840
gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag 3900
aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga ttagccgcta caagatcgta 3960
aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc 4020
gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc accccgatta ctttttgatc 4080
gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa 4140
gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag 4200
ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag 4260
gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc 4320
gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg 4380
gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg 4440
tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca 4500
cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta 4560
aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca 4620
gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct 4680
tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat 4740
ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc 4800
accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 4860
gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 4920
agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt 4980
gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 5040
tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 5100
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 5160
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 5220
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 5280
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5340
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 5400
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 5460
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5520
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5580
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5640
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5700
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5760
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 5820
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 5880
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcattct 5940
aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta ttttctccca atcaggcttg 6000
atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc 6060
gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca 6120
ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg 6180
gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga 6240
tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag atcgttattc 6300
agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat tcgtataggg acaatccgat 6360
atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca gctcgataat cttttcaggg 6420
ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact catgagcaga 6480
ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc 6540
agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt ataccggctg 6600
tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca gcttatatac cttagcagga 6660
gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt caattccggt 6720
gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac 6780
cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc 6840
ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat 6900
cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca 6960
atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt 7020
tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct 7080
gacgccgtcc cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg 7140
gtcggggagc tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct 7200
tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg ccgaattaat 7260
tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg aattagaaat tttattgata 7320
gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa cacatgagcg 7380
aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta ttatggagaa 7440
actcgagtta cttgtacagc tcgtccatgc cgtgagtgat cccggcggcg gtcacgaact 7500
ccagcaggac catgtgatcg cgcttctcgt tggggtcttt gctcagggcg gactgggtgc 7560
tcaggtagtg gttgtcgggc agcagcacgg ggccgtcgcc gatgggggtg ttctgctggt 7620
agtggtcggc gagctgcacg ctgccgtcct cgatgttgtg gcggatcttg aagttcacct 7680
tgatgccgtt cttctgcttg tcggcgagct ctagatctgc agtcgactgg tacccgggca 7740
aatcctcctc tgagatcagc ttctgctcca tcgagagaga tagatttgta gagagagact 7800
ggtgatttca gcgtgtcctc tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag gaaggtcttg 7860
cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac 7920
ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg 7980
tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca 8040
atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat 8100
agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat 8160
agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg 8220
ctccaccatg ttatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt 8280
ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc 8340
ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac cttccttttc 8400
tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga 8460
tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct tctgagactg tatctttgat 8520
attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct ctagccaata 8580
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 8640
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 8700
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 8760
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattagcttg gcactggccg 8820
tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 8880
cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 8940
aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg 9000
tttcccgcct tcagtttagc ttcatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac 9060
tcgccgtaaa gactggcgaa cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga 9120
aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata 9180
cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc 9240
tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag 9300
gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg 9360
ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 9420
ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 9480
acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 9540
tggagagaac acgggggact cttgac 9566
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtacccat acgatgttcc agattacgct 30
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacgtgaatt cactagtaag cttcggatcc atg 33
<210> 4
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgagtaa 519
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcctcctct gagatcagct tctgctccat 30
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctagatct gcagtcgact ggtacccggg 30
<210> 7
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttacttgtac agctcgtcca tgccgtgagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag 60
gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta 120
gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc 180
ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 240
gttcttctgc ttgtcggcga g 261