本发明涉及一种水溶性卡巴他赛抗癌药物的制备方法，属于医药领域。
背景技术：
前列腺癌在临床中是较为常见的一种男性泌尿生殖系统肿瘤，欧美地区具有极高发病率，在男性恶性肿瘤排名中占第2位。我国前列腺癌发病率虽然少于欧美地区，但也具有逐年增长趋势，为男性泌尿生殖系恶性肿瘤排名第3位。目前临床中对前列腺癌治疗时，方法主要包括保守治疗、外科手术治疗、内分泌治疗、化疗等，并根据患者分期差异选用不同治疗措施。卡巴他赛是治疗前列腺癌的一种新药。
卡巴他赛，英文名cabazitaxel，其分子结构式如式Ⅰ所示，化学名(2α,5β,7β,10β,13α)-4- 乙酰基-13-({(2R,3S)-3[(叔丁基氧基羰基)氨基]-2-羟基-3-苯丙酸})-1-羟基-7，10-二甲氧基-9-氧代-5，20-环氧紫杉烷-11-烯-2-苯甲酰氧基-丙烷-2-酮，由赛诺菲-安万特公司研发，是2010年6月17日美国FDA批准上市的紫杉烷类微管抑制剂抗肿瘤药，与泼尼松联用治疗晚期前列腺癌。
卡巴他赛水溶性差，体内毒性大，为解决上述问题，以纳米制剂为基础的给药系统备受关注，如水溶性前药、脂质体、聚合物胶束等。其中，疏水化修饰多糖聚合物胶束以其载药能力强，缓释特性和肿瘤靶向性等优势在药物传递系统领域备受关注。
由N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸组成的天然多糖的透明质酸(HA)与细胞特异性表面标志物如CD44和RHAMM具有很强的亲合力。HA在生物功能上起着重要作用，如稳定和组织ECM，调节细胞粘附和运动，以及介导细胞增殖和分化。HA在许多类型的肿瘤中也与血管发生密切相关，其中HA受体(CD44和RHAMM)在表面上大量过表达。因此，具有高转移活性的恶性细胞通常表现出HA的增强的结合和摄取。HA及其衍生物已广泛用作各种治疗剂的靶向特异性药物递送载体。透明质酸作为药用高分子材料，可以与卡巴他赛偶合，形成前药。现有报道的该药物前体与透明质酸的结合，大多集中于将透明质的COOH进行修饰后与药物前体相连，透明质酸的羧酸部分是透明质酸受体CD44的识别位点，但是该处的位阻较大，不易与卡巴他赛连接。现有的对HA羟基改性的方法，多为与烷基琥珀酸酐或甲基丙烯酸酐进行酯化，但是反应条件不易控制。并且MeHA的取代度(DS)较低，DS 的取值范围也较窄，在一定程度上，酯化不足是导致MeHA水凝胶机械性能不能满足的主要原因之一。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明将透明质酸与二酸酐反应，在透明质酸的羟基处对透明质酸进行修饰，修饰后的透明质酸既能与受体CD44结合，又能与卡巴他赛药物偶联。并且本发明的二酸酐改性方法具有高取代度和高性能。
本发明的第一个目的是提供一种卡巴他赛(CTX)药物前体的制备方法，所述方法是通过二酸酐修饰透明质酸的羟基，然后再与卡巴他赛药物耦联。
在本发明的一种实施方式中，所述卡巴他赛药物前体的结构式如下所示：
在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：
(1)在溶剂存在下，将透明质酸与二酸酐按照一定摩尔比，反应生成透明质酸衍生物；
(2)透明质酸衍生物在缩合剂的存在下，与卡巴他赛发生酯化反应，生成卡巴他赛药物前体。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的溶剂为甲酰胺、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮或六甲基磷酰三胺中的一种或两种以上组合。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸与溶剂的比例为1:70～100(m/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中二酸酐为马来酸酐、邻苯二甲酸酐、丁二酸酐或二甘醇酸酐。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸与二酸酐的摩尔比为1:4～4:1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的反应条件为反应温度为40～60℃，反应时间为4～6h，反应结束后冷却至室温，用溶剂清洗后离心冻干。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中缩合剂为N,N’-二环己基碳二亚胺、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐、4-二甲氨基吡啶、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯或 O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸中的一种或两种以上组合。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的反应条件为反应温度为30～50℃，反应时间为1～3天。
本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的卡巴他赛药物前体。
本发明的第三个目的是提供所述的卡巴他赛药物前体在制备前列腺药物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的卡巴他赛药物前体由亲水基团与卡巴他赛药物通过可断裂的酯键连接，利于前提药物在体内通过水解的方式直接释放抗肿瘤成分。
本发明提供的卡巴他赛药物前体既能溶解于吐温等两亲性表面活性剂又可以溶解于水，这大大增加了卡巴他赛药物的应用范围。
本发明提供的卡巴他赛药物抗癌药物化合物，具有高抗癌活性且毒性更低，所述的化合物不仅可以溶于水，而且在水溶液中能够形成纳米颗粒，具有药物缓释功能。
本发明的水溶性卡巴他赛药物化合物，含有抗癌药物活性部分和亲水部分，抗癌药物活性部分是具有抗癌活性的药物化合物分子卡巴他赛，亲水部分是水溶性透明质酸衍生物。它们以酯键共价结合形成本发明的抗癌药物化合物。
本发明的优点和效果：
(1)本发明的CTX药物前体比临床药物CTX具有相类似的抗肿瘤活性，在体内可缓慢水解，有效减少了体内毒性。
(2)本发明的CTX药物前体在水中有较好的溶解性。
(3)本发明的CTX药物前体靶向性有所增加。
(4)本发明以酸酐修饰透明质酸，再接于卡巴他赛，该聚合物表现出良好的注射安全性、自聚集特性和载药能力。
具体实施方案
下面是对本发明进行具体描述。
实施例1：
马来酸—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80mL的甲酰胺中，50℃下强烈搅拌；将马来酸(透明质酸：马来酸摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于20mL 甲酰胺中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水乙醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水乙醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2molNaOH溶液将上述溶液pH值调至8～9。用去离子水透析24小时。 -63℃下冷冻24h,-112℃真空干燥48h。产率：75～90％。
卡巴他赛药物前体1的制备
将马来酸—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5mL无水DMSO中，分别加入不同摩尔比的DCC和DMAP。将溶液搅拌1小时以激活马来酸—透明质酸衍生物的羧基。将不同量卡巴他赛(10和20mg)溶解在1mL无水DMSO中，并使用注射器在干燥的N2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(MWCO：3500Da)将所得溶液用DMSO透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的卡巴他赛。收集卡巴他赛药物前体1并冻干3天并进行分析。产率：65％～88％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的UV吸光度测量缀合物上卡巴他赛的载药量(重量％)。最低载药量为9.1％，最高载药量为23.8％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体1水溶性显着升高，溶解度从151mg/mL上升到268mg/mL。卡巴他赛药物前体1的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量23.8％的缀合物用于进一步实验。
用卡巴他赛对照，游离卡巴他赛处理48小时后，通过CCK-8测定确定相对细胞活力。与游离卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体1对HepG2和A549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。卡巴他赛药物前体1的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为HepG2和A549细胞都过度表达HA 可识别的CD44受体。此外，卡巴他赛药物前体1的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着卡巴他赛负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的卡巴他赛药物前体1具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的卡巴他赛药物前体1更有可能提高抗肿瘤药效。
实施例2：
邻苯二甲酸酐—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80mL的二甲基亚砜中，50℃下强烈搅拌；将邻苯二甲酸酐(透明质酸：邻苯二甲酸酐摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于20mL二甲基亚砜中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水甲醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水甲醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2mol碳酸钾溶液将上述溶液pH值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h,-112℃真空干燥48h。产率：70～91％
卡巴他赛药物前体2的制备
将邻苯二甲酸酐—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5mL无水DMSO中，分别加入不同摩尔比的DCC和DMAP。将溶液搅拌1小时以激活邻苯二甲酸酐—透明质酸衍生物的羧基。将不同量紫杉醇(10和20mg)溶解在1mL无水DMSO中，并使用注射器在干燥的N 2 下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(MWCO：3500Da) 将所得溶液用DMSO透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的卡巴他赛。收集卡巴他赛药物前体2并冻干3天并进行分析。产率：60～85％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的UV吸光度测量缀合物上卡巴他赛的载药量(重量％)。最低载药量为9.3％，最高载药量为23.2％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体2水溶性显着升高，溶解度从153mg/mL上升到265mg/mL。卡巴他赛药物前体2的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量23.2％的缀合物用于进一步实验。
用卡巴他赛对照，游离卡巴他赛处理48小时后，通过CCK-8测定确定相对细胞活力。与游离卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体2对HepG2和A549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。卡巴他赛药物前体2的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为HepG2和A549细胞都过度表达HA 可识别的CD44受体。此外，卡巴他赛药物前体2的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着卡巴他赛负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的卡巴他赛药物前体2具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的卡巴他赛药物前体2更有可能提高抗肿瘤药效。
实施例3:
丁二酸酐—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80mL的甲酰胺中，50℃下强烈搅拌；将丁二酸酐(透明质酸：丁二酸酐摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于 20mL甲酰胺中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水乙醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水乙醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2molNaOH溶液将上述溶液pH值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h,-112℃真空干燥48h。产率：70～85％。
卡巴他赛药物前体3的制备
将丁二酸酐—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5mL无水DMSO中，分别加入不同摩尔比的DCC和DMAP。将溶液搅拌1小时以激活丁二酸酐—透明质酸衍生物的羧基。将不同量卡巴他赛(10和20mg)溶解在1mL无水DMSO中，并使用注射器在干燥的N2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(MWCO：3500Da)将所得溶液用DMSO透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的卡巴他赛。收集卡巴他赛药物前体3并冻干3天并进行分析。产率：60～85％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的UV吸光度测量缀合物上卡巴他赛的载药量(重量％)。最低载药量为9.5％，最高载药量为24.6％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体3水溶性显着升高，溶解度从154mg/mL上升到272mg/mL。卡巴他赛药物前体3的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量24.6％的缀合物用于进一步实验。
用卡巴他赛对照，游离卡巴他赛处理48小时后，通过CCK-8测定确定相对细胞活力。与游离卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体3对HepG2和A549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。卡巴他赛药物前体3的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为HepG2和A549细胞都过度表达HA 可识别的CD44受体。此外，卡巴他赛药物前体3的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着卡巴他赛负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的卡巴他赛药物前体3具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的卡巴他赛药物前体3更有可能提高抗肿瘤药效。
实施例4:
二甘醇酸酐—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80mL的二甲基亚砜中，50℃下强烈搅拌；将二甘醇酸酐(透明质酸：二甘醇酸酐摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4) 溶解于20mL二甲基亚砜中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水甲醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水甲醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2mol碳酸钾溶液将上述溶液pH值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h,-112℃真空干燥48h。产率：72～85％
卡巴他赛药物前体4的制备
将二甘醇酸酐—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5mL无水DMSO中，分别加入不同摩尔比的DCC和DMAP。将溶液搅拌1小时以激活二甘醇酸酐—透明质酸衍生物的羧基。将不同量卡巴他赛(10和20mg)溶解在1mL无水DMSO中，并使用注射器在干燥的N2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(MWCO：3500Da) 将所得溶液用DMSO透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的卡巴他赛。收集卡巴他赛药物前体4并冻干3天并进行分析。产率：60～83％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的UV吸光度测量缀合物上卡巴他赛的载药量(重量％)。最低载药量为9.2％，最高载药量为24.1％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体4水溶性显着升高，溶解度从151mg/mL上升到269mg/mL。卡巴他赛药物前体4的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量24.1％的缀合物用于进一步实验。
用卡巴他赛对照，游离卡巴他赛处理48小时后，通过CCK-8测定确定相对细胞活力。与游离卡巴他赛相比，卡巴他赛药物前体4对HepG2和A549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。卡巴他赛药物前体4的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为HepG2和A549细胞都过度表达HA 可识别的CD44受体。此外，卡巴他赛药物前体4的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着卡巴他赛负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的卡巴他赛药物前体4具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的卡巴他赛药物前体4更有可能提高抗肿瘤药效。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。