壳聚糖巯基化衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种壳聚糖巯基化衍生物及其制备方法和应用。

背景技术：

壳聚糖是自然界中已知的唯一碱性多糖，具备良好的生物相容性、生物降解性、无细胞毒性，被广泛应用于组织工程和再生医学领域。壳聚糖分子链上含有丰富的氨基基团，具备较好的化学活性。

壳聚糖分子以其独特的分子结构和理化性质在机体内发挥着重要的作用，临床上也得到了广泛应用。但现有的壳聚糖分子不能够与含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应，来制备快速固化的水凝胶。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种壳聚糖巯基化衍生物，其通过将壳聚糖分子中的氨基和伯羟基进行衍生引入巯基进行改性得到，该壳聚糖巯基化衍生物具有很好的亲核性能、抗氧化性能，并且可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，应用范围十分广泛。

本发明的第二个目的在于提供上述壳聚糖巯基化衍生物的制备方法，其路线设计合理，制作方法简单，对设备需求低，能够快速高效地得到壳聚糖巯基化衍生物。

本发明的第三个目的在于提供上述壳聚糖巯基化衍生物在制备水凝胶中的应用，使得制备的水凝胶具有快速固化、生物相容性好以及机械强度可调的性能。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种壳聚糖巯基化衍生物，其由壳聚糖与磺酸基化合物反应再还原生成，其通式为：

其中，r为亚烷基或取代亚烷基。

一种上述壳聚糖巯基化衍生物的制备方法，壳聚糖与磺酸基化合物在羧基活化剂的存在下进行反应；再通过还原剂将磺酸基还原为巯基；磺酸基化合物为同时具有羧基和磺酸基的化合物。

上述壳聚糖巯基化衍生物在制备水凝胶中的应用。

本发明实施方式的壳聚糖巯基化衍生物及其制备方法的有益效果是：该制备方法通过将同时含有羧基和磺酸基的化合物作为修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在壳聚糖分子的氨基和伯羟基上成功引入磺酸基，再在还原剂的作用下将磺酸基还原成巯基。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到壳聚糖巯基化衍生物。该壳聚糖巯基化衍生物由于巯基侧链的作用，而具有很好的亲核性能、抗氧化性能以及丰富的衍生性，其可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，应用范围十分广泛。

本发明实施方式的壳聚糖巯基化衍生物在制备水凝胶上的应用的有益效果是：改性后的形成的壳聚糖巯基化衍生物在碱性条件下巯基质子离去可产生硫负离子，可与含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应来制备得到水凝胶，提高了水凝胶的固化速度，也改善了水凝胶的机械强度和弹性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的壳聚糖与壳聚糖巯基衍生物傅里叶红外图谱(ftir)对比分析图，其中，cs表示壳聚糖，tcs表示壳聚糖巯基化衍生物；

图2为本发明实施例5中的固化后水凝胶的扫描电子显微镜(sem)表面微观结构图；

图3为本发明实施例5中的固化后水凝胶的表面孔径扫描电子显微镜(sem)表面微观结构图；

图4为本发明实施例5中的固化后水凝胶的力学测试曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施方式的壳聚糖巯基化衍生物及其制备方法和应用进行具体说明。

一种壳聚糖巯基化衍生物，其通式为：

其中，r为亚烷基或取代亚烷基。

其中，r为取代亚烷基时，该取代亚烷基可以为至少一个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中至少一种基团取代的亚烷基。即可以是亚烷基中有一个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的一种基团取代；也可以是亚烷基中有两个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的两种基团取代；也可以是亚烷基中有两个以上的氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的两种以上的基团取代；也可以是亚烷基中多个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的多个同一种基团取代或被其中多个不同基团的组合对应进行取代。

其中，r的碳原子数可为1～20个，优选1～15个，更优选1～10个。即r可以为c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20的亚烷基或取代亚烷基。

由于壳聚糖分子链上存在游离的氨基和羟基，从而可以通过与羧基进行反应，达到对壳聚糖分子链进行修饰改性的目的。要在壳聚糖分子中引入巯基，最直接的方式就是将同时具有羧基和巯基的化合物与壳聚糖进行反应。但是，上述反应中，由于羧基的亲电性不足，其只能与壳聚糖分子中亲核性较强的氨基进行反应，而不会与羟基发生反应。而在本发明实施例中，采用同时具有羧基和磺酸基的磺酸基化合物与壳聚糖进行反应，由于磺酸的强吸电子性，磺酸基化合物的羧基亲电性较强，可以同时与壳聚糖中的氨基和伯羟基发生反应，在壳聚糖分子链中引入磺酸基，再通过与还原剂反应，即可将磺酸基还原成巯基，得到氨基和伯羟基均被巯基化后的壳聚糖巯基化衍生物。同时具有羧基和磺酸基的化合物可以通过经水解反应、氨解反应等直接生成，或者可通过含二硫键经还原后再剧烈氧化直接得到。例如，同时具有羧基和磺酸基的化合物可以为：二磺酸基丁二酸、磺酸基乙酸、3-磺酸基丙酸、磺酸基丁二酸等。

具体地，壳聚糖巯基化衍生物由以下反应式生成：

本发明一些实施方式涉及壳聚糖巯基化衍生物的制备方法，包括壳聚糖与磺酸基化合物在羧基活化剂的存在下进行反应，再将磺酸基还原成巯基。

根据一些实施方式，壳聚糖巯基化衍生物的制备方法包括：将含有所述壳聚糖的溶液与含有所述磺酸基化合物的溶液在羧基活化剂的作用下进行反应。

具体地，本发明实施方式中的壳聚糖巯基化衍生物可以通过以下方法制备：

(1)制备含有壳聚糖的溶液：将壳聚糖溶解于0.01～30％的酸溶液中。

(2)制备含修饰剂化合物的溶液：将磺酸基化合物根据其溶解性，溶解于双蒸水或碱溶液或酸溶液中，修饰剂本身为溶液的为便于反应操作可用相应溶剂稀释。

(3)将羧基活化剂加入到上述含磺酸基化合物的溶液中，混合均匀后，调节其ph值至4.5～6.5，继续混合搅拌。

(4)将活化后的含有磺酸基化合物的溶液与含有壳聚糖的溶液进行混合，充分搅拌均匀，优选转移至圆底烧瓶中，放置在温度为50～60℃以下进行恒温反应。

(5)向反应后的反应液中加入适量还原剂，室温下搅拌24h。

(6)将反应后得到的反应液进行透析2～5天，再将得到的透析产物进行冷冻干燥2～5天后，得到壳聚糖巯基化衍生物。通过透析的手段可以除去残留的小分子杂质，从而得到纯度更高的壳聚糖巯基化衍生物。

根据一些实施方式，含有所述壳聚糖的溶液是酸溶液。根据一些实施方式，酸溶液可以是有机酸溶液，优选乙酸溶液。即优选将述壳聚糖溶解于0.01～30％的乙酸溶液中。

根据一些实施方式，含有所述磺酸基化合物的溶液是双蒸水或碱溶液或酸溶液。根据一些实施方式，碱溶液可以为强碱溶液，例如氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钙溶液等，也可以为弱碱溶液，例如氨水溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液等，优选氢氧化钠溶液。双蒸水将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水，其可以使得溶解后的溶液纯度更高，后续反应效果越好。溶解磺酸基化合物的酸溶液可以是有机酸溶液，优选乙酸溶液。

根据一些实施方式，羧基活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)。edc是个可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶联物的制取，常和nhs或n-羟基硫代琥珀酰亚胺连用，以提高偶联效率。nhs即n-羟基琥珀酰亚胺，活化羧基以用于酰胺键的形成。用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体。本发明实施方式中的羧基活化剂可按照edc和nhs的质量比为10：1～1：1的比例进行配制，这种比例有利于二者达到更好的偶联效率，使得对磺酸基化合物的羧基活化效果更好。

根据一些实施方式，可以取edc和nhs在磁力搅拌器作用下加入到上述含磺酸基化合物的溶液中，以达到更好的混合效果。

根据一些实施方式，混合羧基活化剂后，用碱或酸溶液调节加有羧基活化剂的磺酸基化合物溶液的ph值，使得其ph值为4.5～6.5。优选地，用1m氢氧化钠或1m盐酸溶液进行调节ph值。edc和nhs在ph值为4.5～6.5的条件下能够达到对羧基最好的活化效果。

根据一些实施方式，调节ph值后混合搅拌的时间为10～150min，使得羧基活化剂能够对磺酸基化合物的羧基进行充分的活化，以更好地对壳聚糖进行修饰。

根据一些实施方式，反应温度优选55～60℃，进一步优选55℃。反应时间可以为1～8h，优选2～6h，更优选地4～5h。

需要说明的是，上述过程中也可以先进行步骤(2)和(3)，再进行步骤(1)，不会影响最终产物的生成。

本发明实施方式中制备壳聚糖巯基化衍生物的方法操作工艺简单，反应条件温和。其为制备一种新的壳聚糖巯基化衍生物以及水凝胶提供了一种简单可行的新方法。所得的壳聚糖巯基化衍生物可用于再生医学、组织工程支架以及医药卫生领域，应用范围广泛。

需要说明的是，壳聚糖巯基化衍生物也可以与小分子或纳米粒子等发生反应来制备其他化学材料。

上述制备方法得到的壳聚糖巯基化衍生物可在制备水凝胶中进行应用，可以将壳聚糖巯基化衍生物与马来酰化壳聚糖混合后制备水凝胶。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例中的壳聚糖巯基化衍生物的反应方程式为：

具体的反应步骤如下：

(1)将0.3g的壳聚糖溶解于质量分数0.01％的乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)取5ml磺酸基丁二酸溶液，加双蒸水稀释至50ml。

(3)取0.8gedc和0.2gnhs在磁力搅拌器作用下一次加入上述磺酸基丁二酸溶液中，充分混合均匀，再用1m稀盐酸调节上述混合溶液的ph至6.5，将混合溶液搅拌30min，使羧基充分活化。

(4)将羧基活化后的磺酸基丁二酸溶液与壳聚糖乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为55℃下恒温反应数5h。

(5)将用盐酸处理过表面氧化锌的金属锌颗粒加入到上述反应液中，室温搅拌24h。

(6)经过反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到壳聚糖巯基化衍生物。

实施例2

本实施例中的壳聚糖巯基化衍生物的反应方程式为：

具体的反应步骤如下：

(1)将4.5g的壳聚糖溶解于质量分数30％的乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)取2.8g2-磺酸基烟酸，加双蒸水稀释至50ml。

(3)取1.6gedc和0.4gnhs在磁力搅拌器作用下一次加入上述2-磺酸基烟酸溶液中，充分混合均匀，再用1m稀盐酸调节上述混合溶液的ph至6.5，将混合溶液搅拌30min，使羧基充分活化。

(4)将羧基活化后的2-磺酸基烟酸溶液与壳聚糖乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为60℃下恒温反应数3h。

(5)将用盐酸处理过表面氧化锌的金属锌颗粒加入到上述反应液中，室温搅拌24h。

(6)经过反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到壳聚糖巯基化衍生物。

实施例3

本实施例中的壳聚糖巯基化衍生物的反应方程式为：

具体的反应步骤如下：

(1)将2.1g的壳聚糖溶解于质量分数2％的乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)取4.5g3-磺酸基丙酸，加双蒸水稀释至50ml。

(3)取1.0gedc和1.0gnhs在磁力搅拌器作用下一次加入上述3-磺酸基丙酸溶液中，充分混合均匀，再用1m稀盐酸调节上述混合溶液的ph至5.5，将混合溶液搅拌60min，使羧基充分活化。

(4)将羧基活化后的3-磺酸基丙酸溶液与壳聚糖乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为50℃下恒温反应数8h。

(5)将用盐酸处理过表面氧化锌的金属锌颗粒加入到上述反应液中，室温搅拌24h。

(6)经过反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到壳聚糖巯基化衍生物。

实施例4

本实施例中的壳聚糖巯基化衍生物的反应方程式为：

具体的反应步骤如下：

(1)将0.15g的壳聚糖溶解于质量分数0.01％的乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)取0.09g磺酸基乙酸，加双蒸水稀释至50ml。

(3)取0.090gedc和0.009gnhs在磁力搅拌器作用下一次加入上述磺酸基乙酸溶液中，充分混合均匀，用1m稀盐酸调节上述混合溶液的ph，使其ph为6.5，再搅拌30min时间，使羧基充分活化。

(4)将活化后的磺酸基乙酸溶液加入壳聚糖乙酸溶液中拌150min时间，充分搅拌均匀，并将混合液转移至圆底烧瓶中，在温度55℃以下恒温反应数5h。

(5)将用盐酸处理过表面氧化锌的金属锌颗粒加入到上述反应液中，室温搅拌24h。

(6)经过反应的反应液经透析3d、冷冻干燥3d后，得到壳聚糖巯基化衍生物。

实施例5

准确称取壳聚糖1.5g溶于质量分数0.01％质量分数的乙酸溶液中，在磁力搅拌器作用下基本溶解均匀后，置于超声振荡器中超声30min左右。准确称取马来酸酐1.8g，加入5ml丙酮使其完全溶解。将溶解后的马来酸酐匀速缓慢的加入壳聚糖乙酸溶液中，在磁力搅拌器下搅拌20min左右使其充分混匀。将混合均匀的液体转入150ml圆底烧瓶中，置集热式磁力搅拌器中，设置温度40℃，恒温加热反应2h。反应停止后透析三天，每隔5h换一次透析液。冷冻干燥三天左右得到mcs产物。

化学反应式：

准确称取mcs60mg，用一定质量分数的乙酸溶液溶解，超声震荡，氮气除气泡，配成浓度为10mg/ml的溶液。准确称取实施例1中的壳聚糖巯基化衍生物(tcs)60mg，用氢氧化钠溶液溶解，超声震荡，氮气除气泡，配成浓度为10mg/ml的溶液，用还原剂处理10min左右，震荡混合均匀。将配好的mcs和tcs溶液在3d打印机上由进样系统进样，计算机程序控制出样速度和打印模式，均匀混合制备3d生物打印水凝胶。

对实施例1中的壳聚糖以及壳聚糖巯基化衍生物傅里叶红外分析图谱，分别得到图1，图1中壳聚糖与巯基化壳聚糖红外图谱对比分析可以看出，巯基化壳聚糖在波数3400cm^-1附近，可以看到羧基上的-oh伸缩振动；在2900cm^-1附近，表示支链上引入的c-h伸缩振动；在1500cm^-1～1650cm^-1附近的酰胺ⅰ带和酰胺ⅱ带，修饰后的壳聚糖酰胺带加强；在1100cm^-1附近，修饰后的壳聚糖因为羧基的引入，在该位置出现明显的c-o伸缩振动峰；在2100cm^-1附近的-nh3⁺的吸收带，壳聚糖被修饰后游离氨基减少，质子化氨基含量减少，-nh3⁺的吸收带峰强度明显减小，以上现象表明巯基成功引入到壳聚糖链上。同时，通过扫描电镜对固化后的水凝胶的表面结构和表面孔径做扫描电镜(sem)分析。结果依次如图2，图3所示。sem分析表明固化后水凝胶表面出现很多交联后的孔洞，说明交联反应进行得很完全，进一步说明制备得到的壳聚糖巯基化衍生物可以成功制备快速固化水凝胶。

进一步地，通过用instron力学测试机对实施例5中得到的水凝胶进行测试，使用10n传感器，置于传感器压缩基底上，根据样品的大小设置好测试参数，测试曲线出现突变后，停止压缩，系统自动得出弹性模量值。

测试参数为：长10mm，宽8mm，高5mm，压缩速率0.8mm/min。测试结果如图4所示，在压缩率为75％，压缩应力约为700kpa时发生断裂，因此，可以看出该水凝胶具有较好的机械强度和弹性性能。

综上所述，本发明实施方式中，通过将同时含有磺酸基和羧基的磺酸基化合物作为修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在壳聚糖分子链上的氨基和伯羟基成功引入磺酸基，并进一步通过还原得到巯基。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到壳聚糖巯基化衍生物。该壳聚糖巯基化衍生物由于巯基侧链的作用，而具有很好的亲核性能、抗氧化性能以及丰富的衍生性，其可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，其应用范围十分广泛。例如，将该壳聚糖巯基化衍生物与含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应，来制备快速固化的水凝胶，在再生医学和组织工程领域有重要的应用。又比如，由于该壳聚糖巯基化衍生物较好的亲核性能以及生物相容性，可以将该壳聚糖巯基化衍生物用于制备药物载体，其良好的亲核性能，利于其与靶细胞的结合，可以达到增加药效的目的；或者，利用该壳聚糖巯基化衍生物良好的抗氧化性能，将其与天然聚合物制成高分子膜，在储存保鲜领域，发挥其作用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。该壳聚糖巯基化衍生物具有丰富的变化和衍生性，其适用广泛，此处仅仅列举了其可能的部分用途，并不能穷举，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例或者其它可能的应用方式，都属于本发明保护的范围。