本发明属于菌株分子标记技术领域，特别涉及一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用。
背景技术：
灵芝[ganodermalucidum(fr.)karst]隶属于担子菌亚门(basidiomycotina)，担子菌纲(basidiomycetes)，多孔菌科(polyporaceae)，灵芝属(ganoderma)，是一种为人熟知的药用真菌。又被称为“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫长生草、灵草、还魂草，在我国有悠久的药用历史。全世界已知的灵芝有100多种，在我国的南北山区均有分布。我国灵芝的人工栽培已经有60多年的历史，野生灵芝的资源十分有限，近年来灵芝的开发越来越受到人们的重视，人工栽培规模越来越大，同时出现了栽培技术和栽培原料的多样化。
灵芝的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是灵芝生产的前提和关键。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于灵芝可以无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存在。这给菇农和生产企业带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个灵芝产业的发展产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着人工栽培的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证生产。
针对目前对于灵芝菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快捷有效的菌株鉴定体系。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80-3菌株的专一性。
本发明的一种灵芝80-3菌株(保藏编号：cgmccno.12879)的特异性分子标记，采用特异性引物对灵芝菌株进行pcr扩增，回收pcr产物作为模板，再以另一组特异引物进行pcr扩增，无dna片段产生。
本发明所采用的灵芝80-3菌株(ganodermalucidum)，保藏单位名称：cgmcc中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.12879，保藏日期为2016年9月19日。建议分类命名为：灵芝(ganodermalucidum)。
本发明的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：
(1)提取灵芝80-3菌株的基因组dna；
(2)进行pcr扩增反应；其中，引物序列为：
l2f4：cctagcccaactgcacaaga；
l2r4：cgtgagtttagccaccggat；(引物序列基于沪农灵芝1号菌株的pyrf基因前后dna碱基序列而设计)
(3)对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；
(4)以切胶纯化产物再次进行pcr扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，引物序列为：
3f4：cgacttcgcgtatgaccg；
3r4：gggtcagaaccatgcgagtt；(引物序列基于灵芝80-3菌株的pyrf基因的突变位点而设计)。
所述步骤(1)中的灵芝80-3菌株的基因组dna的提取方法具体为：将灵芝80-3菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的ctab法提取基因组dna，-20℃贮藏备用。
所述改进的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为：将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×ctab抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；12000rpm、4℃离心10min，取上清液；在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/l醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；加入100μl10×te(tris/edta)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；加入1μl10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h，去除rna；将得到的dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
所述步骤(2)中的pcr扩增反应的扩增体系为50μl，包含：takaraextaq0.5μl，10×extaqbuffer5μl，dntpmixture4μl，模板dna1μl，引物各1μl，双蒸水37.5μl。
所述步骤(2)中的pcr扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
所述步骤(3)对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取pcr扩增产物5μl，与1μl加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于tae缓冲液中，5v/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1414bp左右的条带进行回收。
所述步骤(4)以切胶纯化产物再次进行的pcr扩增反应的体系为50μl，包含：takaraextaq0.5μl，10×extaqbuffer5μl，dntpmixture4μl，模板dna1μl，引物各1μl，双蒸水37.5μl。
所述步骤(4)中的pcr扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
所述步骤(4)对琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取pcr扩增产物5μl，与1μl加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于tae缓冲液中，5v/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
本发明的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的应用，用于鉴别灵芝80-3菌株。
本发明原理：根据灵芝80-3菌株的pyrf基因突变，分析突变序列的特异性和稳定性，建立以突变基因为分子标记的快速鉴别灵芝80-3菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对灵芝菌株进行pcr扩增，对pcr产物回收后以其为模板，再以另一组特异引物进行pcr扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测，灵芝80-3再次进行pcr扩增后无dna片段产生，其它灵芝菌株再次pcr扩增出的dna片段长度为606bp。
有益效果
(1)本发明方法简单，成本低，对灵芝菌株pyrf基因进行pcr扩增后回收，并再次进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，无条带生成即为80-3菌株；
(2)本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本发明仅需4天，并且在收集的灵芝菌株中具有80-3菌株的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为灵芝不同菌株pyrf基因的pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测；其中，m：dl2000marker；1：沪农灵芝1号；2：80；3：80-3；
图2为灵芝不同菌株pyrf基因的pcr产物酶切电泳检测；其中，m：dl2000marker；1：沪农灵芝1号；2：80；3：80-3；4：沪农灵芝1号再次pcr；5：80再次pcr；6：80-3再次pcr。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.材料：试验所使用的灵芝菌株80-3(cgmccno.12879)由中国普通微生物菌株保藏管理中心保藏。沪农灵芝1号菌株由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心保藏，80菌株为沪农灵芝1号原生质体分离得到的单核菌株。
2.pcr引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
表1两次pcr扩增的引物
3.培养基：马铃薯葡萄糖培养基(pd培养基)：马铃薯20g、葡萄糖20g，加水至1l，灭菌后使用。
4.菌丝培养：将灵芝菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下避光摇瓶培养，4d后收集菌丝。
5.用ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取灵芝菌株基因组dna：
(1)将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×ctab抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；
(2)12000rpm、4℃离心10min，取上清液；
(3)在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
(4)在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/l醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
(7)加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
(8)加入100μl10×te(tris/edta)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
(9)加入1μl10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h，去除rna；
(10)将得到的dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
6.pcr克隆相关基因：
pcr扩增体系为50μl，包含：takaraextaq(5u/μl)0.5μl，10×extaqbuffer(mg2+plus)5μl，dntpmixture(2.5mmol/l)4μl，模板dna(100ng/μl)1μl，引物各1μl(见表1)，双蒸水(ddh2o)37.5μl。pcr反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
提取灵芝菌株基因组dna后对pyrf基因进行pcr扩增，pcr结果显示所有的灵芝菌株都在1414bp左右出现条带。如图1箭头标注所示。
7.对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化：
取pcr扩增产物5μl，与1μl加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于tae缓冲液中，5v/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1400bp左右的条带进行回收。
8.对切胶纯化产物再次进行pcr扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测：
对切胶纯化产物再次进行pcr扩增的体系为50μl，包含：akaraextaq(5u/μl)0.5μl，10×extaqbuffer(mg2+plus)5μl，dntpmixture(2.5mmol/l)4μl，模板dna(100ng/μl)1μl，引物各1μl(见表1)，双蒸水(ddh2o)37.5μl。pcr反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取再次pcr扩增产物5μl，与1μl加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于tae缓冲液中，5v/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带dna，经过再次pcr扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示灵芝80-3菌株再次进行pcr扩增后无dna片段产生，其它灵芝菌株再次pcr扩增出的dna片段长度为606bp。
sequencelisting
<110>上海市农业科学院
<120>一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
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