一种小单孢菌菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小单胞菌菌株及其应用，小单胞菌菌株命名为Micromonospora?aurantiaca，中文名为桔橙小单孢菌，株号为ZHY1-5，分离自生产萜烯树脂的污水处理厂的活性污泥，保藏号为CGMCC?No.8215，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的小单胞菌菌株应用于α–萜烯的降解，效果较好，尤其对α‐蒎烯的降解效果显著；本发明放电小单孢菌菌株还应用于萜烯化合物合成废水处理中，对萜烯类化合物合成废水具有较好的处理效果；还用于苯系类化合物化工废水处理中。
【专利说明】一种小单孢菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株小单胞放线菌降解α -萜烯化合物的【技术领域】，具体涉及到菌 的富集培养、筛选、分离及菌株底物谱的验证、处理萜烯化合物合成废水的工艺方法。
【背景技术】
[0002] 萜烯类化合物作为重要的化工中间体，广泛用于木材加工、香料制造、制药、化工 等行业。这些行业生产过程中所产生的废水含有大量的有机物质，C0D高、毒性大、难生化 降解，属于典型的高浓度难降解有机废水。
[0003] 萜烯类化合物结构多样，大多萜烯类化合物具有挥发性，在大气中形成气溶胶 粒子，易造成呼吸道疾病，危害人们的身体健康。有些萜烯类化合物具有较强的还原性， 会与大气中的臭氧、轻基等自由基发生反应，形成光化学烟雾，破坏臭氧层（Temperature dependence of the range between243K and303K.Physical Chemistry Chemical Physics，2009, 11 (13) :2323-2328)。所以萜烯类化合物合成废水如果处理不当排放，将导 致严重的环境污染，因此必须对该类废水加大处理力度。
[0004] 其中具有环烯烃结构的α -菔烯（C1(IH16)是单萜类物质的典型代表，它进入大气 后，直接危害人类健康，并与大气中的臭氧、羟基等自由基发生反应，形成光化学烟雾，破 坏臭氧层。目前已报道的对α-菔烯有降解作用的微生物主要有假单胞菌（一株α-菔 烯降解菌的分离鉴定及降解特性研究.中国环境科学，2011，31(4) :622-630)，芽孢杆菌 (Degradation ofpinene by Bacillus pallidus BR425. Biodegradation,1998,9 (5):3 37-341)，曲霉菌（Bioconversion of alpha pinene to verbenone by resting cells ofAspergillus niger. Applied Microbiology and Biotechnology，2000,53(3):335-33 7)，诺卡氏菌（Kroppenstedt. Bacterial degradation of natural rubber:aprivilege of actinomycetes. FEMS Microbiol. Lett. 1997,150 (5) : 179-188)，戈登氏菌（Gordonia polyisoprenivorans sp.nov., a rubber-degradingactinomycete isolated from an automobile tyre. Int. J. Syst. Bacteriol. 1999, 49 (4) : 1785-1791)等。
[0005] 虽然在Actinomyces和Micromonospora里都有报道对硝烯化合 物降解的菌株（Biodegradation of cis_l，4-polyisoprene rubbers by distinctActinomycetes:Microbial strategies and detailed surface analysis. Appl. Environ. Microbiol，2000, 66 (4) : 1639-1645)，但是海洋小单抱菌（Micromonospora marine)对硝烯化合物能够降解尚无报道。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种小单胞菌菌株及其应用，该小单孢菌具有较广的降解底物谱， 对萜烯化合物合成废水具有较好的处理效果。
[0007] 一种小单胞菌菌株，命名为Micromonospora aurantiaca，中文名为桔橙小单孢 菌，株号为ZHY1-5,保藏号为CGMCC No. 8215。
[0008] 本发明的桔橙小单孢菌（Micromonospora aurantiaca) ZHY1-5保藏于位于北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏日期为2013年9月18日。
[0009] 所述桔澄小单抱菌（Micromonospora aurantiaca) ZHY1-5分离自生产廠烯树脂的 污水处理厂的活性污泥。
[0010] 所述桔橙小单孢菌ZHY1-5的分离培养基成分如下：
[0011] 无机盐培养基（MM)(g/L):K2HP04.3H200.6g，KH 2P040.15g，NaN032.25g， NH4C12. 86g，MgCl20. 06g，CaCl20. 006g，FeS04 · 7Η200· 003g ;微量元素母液 5mL(ZnCl288mg/ L，MnCl260mg/L，KI10mg/L，Na 2Mo04100mg/L，H3B0450mg/L)，pH 为 7. 0-7. 2 ;121°C 灭菌 20min， 添加一定浓度的ct -菔烯为唯一碳源。
[0012] 所述桔橙小单孢菌ZHY1-5生长LB培养基成分如下：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉 5g/L，NaC110g/L，葡萄糖 lg/L，ρΗ7· 0-7. 2 ;
[0013] 本发明还提供了一种所述小单胞菌菌株在降解萜烯化合物合成废水中的应用，尤 其是在萜烯降解中的应用。
[0014] 本发明的小单胞菌菌株应用于萜烯的降解，效果较好，尤其对α -菔烯的降解效 果显著。
[0015] 本发明的小单胞菌菌株应用于α -菔烯降解的方法如下：
[0016] 取对数生长期的桔橙小单孢菌ΖΗΥ1-5菌株，离心收集菌体，无菌水洗涤，无菌水 重悬后调〇D_到1. 5,得新鲜菌液；将所述新鲜菌液接种至含有α -菔烯为唯一碳源的无 机盐液体培养基中，摇瓶培养。
[0017] 优选地，所述摇瓶培养在28?30°C摇瓶培养45?50小时；进一步优选为在30°C 摇瓶培养48小时。
[0018] 优选地，所述无机盐培养基中α -菔烯的浓度为180?200mg/L，进一步优选地， 所述无机盐培养基中ct -菔烯的浓度为200mg/L。
[0019] 摇瓶培养时的转速优选为180rpm。
[0020] 摇瓶中优选盛装l〇〇ml培养基，每次接种3ml重悬后的新鲜菌液。
[0021] 通过气相色谱分析α -菔烯的降解率，本发明的菌株对α -菔烯的降解率可达到 85%以上。
[0022] 所述无机盐液体培养基（ΜΜ)的成分为（g/L) :Κ2ΗΡ04 · 3H200. 6g，KH2P040. 15g， NaN032. 25g，NH4C12. 86g，MgCl20. 06g，CaCl20. 006g，FeS04 · 7Η200· 003g ;微量元素母液 5mL(ZnCl288mg/L，MnCl260mg/L，KI10mg/L，Na 2Mo04100mg/L，H3B0450mg/L)，pH 为 7· 0-7. 2 ; 121°C灭菌20min，添加 α -菔烯为唯一碳源。
[0023] 同时，本发明的桔橙小单孢菌ΖΗΥ1-5具有较广的降解谱，在无机盐培养基中分别 添加200mg/L的不同底物（苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、石油醚、环己烷、 正己烯、环己烯、十四烷、二十八烷、甲基乙基酮等工业中常见的污染物作为唯一碳源），对 有机物均有不同程度的降解。
[0024] 本发明还提供了一种所述小单孢菌菌株在萜烯类化合物合成废水处理中的应用， 对萜烯类化合物合成废水具有较好的处理效果。
[0025] 处理方法如下：
[0026] ⑴挑取桔橙小单孢菌ZHY1-5菌株接种在lOOmL液体LB培养基中，35°C，180转 /分振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水洗涤3次，重悬至0D_到1. 5,获得新 鲜菌液；
[0027] (2)取生产萜烯树脂企业污水处理厂的活性污泥和污水处理厂的出水，活性污泥 按照重量分数为30%的量投加到所取出水中，将新鲜菌液接种至活性污泥与出水的混合液 中，搅拌培养。
[0028] 优选地，30°C，180rpm培养48h，静置去除上清液后再添加至与第一次同样体积的 出水，30°C，180rpm培养48h，最后测定水样中C0D的去除情况。
[0029] 步骤⑵中所取出水中C0D为500?600mg/L。
[0030] 步骤（2)中重悬后的菌液的接种量为1?3%。
[0031] 采用本发明菌株处理后的出水C0D的降解率达30%以上，随着接种量的增加降解 率升高。
[0032] 本发明还提供了一种所述小单孢菌菌株在苯系类化合物化工废水处理中的应用。
[0033] 处理方法如下：
[0034] ⑴挑取菌株ZHY1-5单菌落接种在100mL的液体LB培养基中，35°C、180转/分 振荡培养至对数生长期，获得新鲜菌液。
[0035] (2)采用厌氧一一级接触氧化一二级接触氧化一出水的工艺处理，厌氧反应器内 投加处理苯系类化合物化工废水的厌氧污泥，含泥量为l〇g/L ;接触氧化池内以组合填料 做载体，在接触氧化池里加入处理苯系类化合物化工废水的好氧池活性污泥5g/L，每天按 照5% (V/V)投加新鲜菌液，连续投加一周，进行驯化挂膜。
[0036] 在这一周的驯化挂膜过程中进水为该企业污水处理厂调节池的水，C0D基本在 3500mg/L 左右，前 3 天，HRT 为 48h，D0 为 2. 5mg/L。驯化后 4 天，HRT 为 36h，D0 为 2. 5mg/ L。经过一周的驯化后，第八天开始，HRT为24h，DO为2. 5mg/L连续进水。从第三天开始， 每天测定出水C0D的浓度，对C0D的降解率达到90%以上。
[0037] 本发明的小单孢菌菌株还可以应用于处理生成维生素 E的废水处理中，处理方法 类似于苯系类化合物化工废水，对此类化工废水的C0D降解率在90%左右。
[0038] 本发明的菌株对化工废水具有较好的处理效果，尤其对石油类废水、含芳烃类废 水处理效果较好。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0040] 本发明的菌株具有较广的降解谱，在工业废水处理中，可以使得污水处理成本降 低。对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。
【具体实施方式】
[0041] 实施例1放线菌桔橙小单孢菌（Micromonospora aurantiaca) ZHY1-5的获得及鉴 定
[0042] 一、菌株的获得及鉴定
[0043] (1)初筛：取生产萜烯树脂的废水处理系统的活性污泥10g，接种在含有200mg/ L α -菔烯的无机盐液体培养基中，30°C，160rpm摇床富集培养5天，取lmL富集菌液接种在 新的含相同浓度的α -菔烯的液体培养基中，再富集2次。然后取lmL菌液用无菌水进行 梯度稀释，涂布于含200mg/L α -菔烯的无机盐培养基上，平板倒置30°C培养，观察平板上 长出单菌落，然后挑取不同形态、颜色的菌落显微镜观察，将形态相同的菌落在平板培养基 上划线分离纯化。
[0044] 所述菌株的分离培养基成分如下：无机盐液体培养基（MM) (g/ L) :K2HP04 · 3H200. 6g, KH2P040. 15g, NaN032. 25g, NH4C12. 86g, MgCl20. 06g, CaCl20. 006g, FeS04 ·7Η200· 003g ;微量元素母液 5mL(ZnCl288mg/L，MnCl260mg/L，KI10mg/L，Na2Mo0 4100mg/ L，H3B0450mg/L)，pH为7. 0-7. 2 ;121°C灭菌20min，添加一定浓度的a -菔烯为唯一碳源。
[0045] (2)复筛：将不同形态的单菌落接种在液体LB培养基中培养，培养至对数生长期， 用无菌水离心洗涤3次后，调0D_至1. 5,接种lmL菌液到含有200mg/L a -菔烯的液体无 机盐培养基，在30°C，160rpm培养48h，气相色谱法测定其降解效果，筛选出一株降解效果 好的菌株。
[0046] 所述菌株生长培养基液体LB培养基成分如下：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L， NaC110g/L，葡萄糖 lg/L，ρΗ7· 0-7. 2 ;
[0047] 步骤（2)中α -菔烯的降解率采用气相色谱分析检测方法：
[0048] 对摇瓶上方α -菔烯气体进行定量分析，色谱柱为HP-Innowax型毛细管柱（30m χ0· 32mm χ(λ 5 μ m)，进样口 250°C，检测器（FID) 280°C，柱温为 140°C，流速 lmL/min。程序 升温：40°C，lmin，20°C /min 至 120°C，60°C /min 至 180°C，2min。流速 lmL/min，进样体积 l.o μ L。液相中α -菔烯经正己烷萃取后采用气相色谱进行定量分析。
[0049] 二、菌株的鉴定
[0050] 16S rDNA 序列鉴定
[0051] F27 :5，-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3，（SEQ ID NO. 1)
[0052] R1492 :5，-TACCTTGTTACGACTT-3，（SEQ ID NO. 2)
[0053] 采用上述引物进行PCR扩增，从菌株ZHY1-5中扩增到16S rDNA基因片段，将所获 得16S rDNA克隆到pGEM T-easy载体后送上海基康生物技术有限公司测序。16S rDNA的 部分序列如SEQ ID N0. 3所示，在GenBank登录号为KJ721976。
[0054] 与GenBank中的序列比对发现，菌株ZHY1-5的16S rDNA序列与Micromonospora aurantiaca菌株序列的同源性为99%。
[0055] 三、菌株ZHY1-5的保藏：
[0056] 通过以上鉴定结果，确认菌株为Micromonospora aurantiaca，将其命名为桔橙小 单孢菌（Micromonospora aurantiaca)ZHYl_5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（CGMCC)，保藏日期为2013年9月18日，保藏号为CGMCC No. 8215。
[0057] 实施例2菌株ZHY1-5在无机盐基础液体培养基对不同化合物的降解
[0058] (1)、从平板挑取一环菌接种在液体生长培养基（液体LB培养基）中，35°C， 160rpm培养至对数生长期，12000rpm离心收集菌体，用无菌水洗漆3次，无菌水重悬后调 〇D_到1. 5,接种3mL到分别添加200mg/L各种有机物为唯一碳源的无机盐液体培养基中， 在250mL摇瓶中装有100mL培养基，30°C，180rpm摇床培养48h后，分别取样测定对不同底 物的降解率，以不接种的空白为对照。
[0059] (2)、在无机盐培养基中添加的有机污染物是BTEX苯系物（苯、甲苯、乙苯、邻二甲 苯、间二甲苯、对二甲苯）、石油醚、环己烷、正己烯、环己烯、十四烷、二十八烷、甲基乙基酮、 α -菔烯。
[0060] (3)、有机物的分析检测方法：ΒΤΕΧ、石油醚、环己烷、正己烯、环己烯、十四烷、 二十八烷等萃取后同样采用气相色谱定量测定，色谱柱为HP-Innowax型毛细管柱（30m χ0· 32mm χ0· 5 μ m)，进样口 250°C，检测器（FID) 300°C，柱温为 160°C，流速 lmL/min，进样体 积 1· 0 μ L。
[0061] 甲基乙基酮采用气相色谱直接测定：HP-Innowax型毛细管柱（30m χ0· 32mm x0. 5 μ m)，进样口 250 °C，检测器（FID) 280°C，柱温为120°C，流速lmL/min，进样体积 1· 0 μ L。
[0062] α -菔烯的检测方法采用气相色谱：对摇瓶上方α -菔烯气体进行定量分析，色谱 柱为 HP-Innowax 型毛细管柱（30m χ(λ 32mm χ(λ 5 μ m)，进样口 250°C，检测器（FID) 280°C， 柱温为 140°C，流速 lmL/min。程序升温：40°C，lmin，20°C /min 至 120°C，60°C /min 至 180°C， 2min。流速lmL/min，进样体积l.OyL。液相中a -菔烯经正己烧萃取后采用气相色谱进 行定量分析。
[0063] 表1 :菌株对各种有机物的降解情况
[0064]
【权利要求】
1. 一种小单胞菌菌株，其特征在于，命名为Micromonosporaaurantiaca，保藏号为 CGMCC No. 8215〇
2. -种如权利要求1所述小单胞菌菌株在降解萜烯中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述萜烯为α -菔烯。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，降解所述α -菔烯的方法如下： 取对数生长期的所述小单胞菌菌株，离心收集菌体，无菌水洗涤，无菌水重悬后调〇D_ 到1.5,得新鲜菌液；将所述新鲜菌液接种至含有α -菔烯为唯一碳源的无机盐液体培养基 中，摇瓶培养。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述摇瓶培养在28?30°C摇瓶培养45? 50小时。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机盐液体培养基中α -菔烯的浓 度为 180 ?200mg/L。
7. -种如权利要求1所述小单孢菌菌株在萜烯类化合物合成废水处理中的应用。
8. -种如权利要求1所述小单孢菌菌株在苯系类化合物化工废水处理中的应用。
【文档编号】C02F101/32GK104120096SQ201410261781
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】王慧荣, 徐佳佳, 梅荣武, 韦彦斐, 李明智, 任旭峰 申请人:浙江省环境保护科学设计研究院