本发明属于基因工程技术领域，涉及一种用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的方法。
背景技术：
月季(学名：rosahybrid)，被称为花中皇后，蔷薇科。常绿，半常绿低矮灌木，四季开花，一般为红色，或粉色、偶有白色和黄色，可作为观赏植物，花成大型，由内向外，呈发散型，有浓郁香气，可广泛用于园艺栽培和切花。
月季是世界“四大切花”之首，但目前转基因体系还不成熟，严重阻碍了对其生长发育分子机制的深入研究，尤其是月季的开花过程，需要一定时间的营养积累期才能实现，表型鉴定周期较长。
目前，月季的转基因体系主要有稳定转化和瞬时转化两种方法。关于稳定转化方法申请公开和授权的相关专利主要有利用芽点(公开号cn103146748a)和体细胞胚(公开号cn102220372b)两种。利用茎段产生的芽点进行基因转化的缺点是增殖系数低，每个芽点需要刻伤，工序繁琐；利用体细胞胚进行转基因操作最大的缺点是体细胞胚的诱导困难、周期长，转化效率低。关于瞬时转化方法主要有申请者创建的“月季不定芽真空渗透转化法(luetal,plantmethods,2017,13:116)”，本方法的主要缺点的转基因的表达窗口期一般为3-7天，对于研究开花这样较长周期的生理过程，显得无能为力。
为了克服月季瞬时转化基因表达时间短的弊端，急需创建以病毒诱导的基因沉默体系为媒介、以带芽茎段为转化材料，结合扦插繁殖技术为一体的基因瞬时转化方法，以实现对开花基因的功能鉴定。
参考文献：
junlu,mengjuanbai,haoranren,jinyiliu,changquanwang.anefficienttransientexpressionsystemforgenefunctionanalysisinrose.plantmethods,2017,13:116
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的基因瞬时转化方法，该种方法简便易行、材料易得、表型鉴定周期短、转化效率高，便于高通量操作。
本发明的第一个目的是提供rcco基因片段，包含以下(1)～(3)中任一所述的核苷酸序列：
(1)如seqidno.1所示的核苷酸序列：
(ctgaatccggtgaagaacagcaacggcaaccataacagtaacaacaatccaaataataacaacaacggtttcttcttcggagtggaggttgatgagtacttggattttgtggagtacaactcatctgatcagaaccagctcagtacgactactgctagtactgaccagcataaccagtatggtgtgccgcacaagatcagttatggaggtgatagtgttgtaccagttcagtatggagaaggt)；
(2)如seqidno.1所示的核苷酸序列的互补序列；
(3)具有seqidno.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与seqidno.1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供rcco基因片段在构建基于烟草脆裂病毒(trv)的病毒诱导基因沉默载体中的应用。
具体的，上述rcco基因片段作为干扰片段，构建基于烟草脆裂病毒(trv)的病毒诱导基因沉默载体，所述载体转化目标植株后，可干扰目标植株内源的rcco基因表达，使植株内源rcco基因发生沉默。
本发明的第三个目的是提供含有上述rcco基因片段的重组表达载体。
进一步的，所述重组表达载体是trv介导的rcco基因病毒诱导基因沉默载体，为将前述的rcco基因片段插入到trv2载体的kpni和xhoi位点之间得到的植物表达载体trv2-rcco。
本发明的第四个目的是提供含有权利要求1所述rcco基因片段的转基因工程菌。
进一步的，所述转基因工程菌通过将前述的植物表达载体trv2-rcco转化感受态农杆菌得到。
本发明的第五个目的是提供前述的rcco基因片段和重组表达载体和转基因工程菌在快速鉴定月季开花基因功能中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种快速鉴定月季基因功能的方法，将内源目的基因片段作为干扰片段，将含有内源目的基因片段的trv2病毒沉默表达载体质粒瞬时转化月季，诱导月季内源目的基因发生沉默，从而鉴定该内源目的基因的功能。
进一步的，包括以下步骤：
s1：取月季当年生长且尚未充分木质化的枝条，去掉顶部嫩梢和基部部分，将枝条剪成带2-3个芽的茎段，上切口平剪(与茎段垂直)，下切口剪成马蹄形，用水冲洗30分钟后备用；
s2：以月季的cdna为模板,以rcco的保守序列设计引物，引物预先添加kpni(gggtacc)和xhoi(cctcgag)酶切接头，特异引物为rcco-kpni-f：gggtacctgaatccggtgaagaacagcaac(seqidno.2)和rcco-xhoi-r：cctcgagaccttctccatactgaactggtac(seqidno.3)进行pcr扩增，得到rcco干扰片段扩增产物(seqidno.1)；用内切酶kpni和xhoi双酶切rcco干扰片段扩增产物和质粒trv2，得到rcco干扰片段酶切产物和线性化的trv2；通过t4dna连接酶将rcco干扰片段酶切产物插入到trv2的多克隆位点，然后转化农杆菌dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中摇菌过夜，再在含有相同抗生素(50mg/l卡那霉素)的lb固体培养基上筛选阳性单克隆，用上述扩增引物(seqidno.2、seqidno.3)做菌落pcr鉴定阳性克隆并测序，将测序正确后的阳性连接质粒trv2-rcco转化农杆菌gv3101，在含有50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平的lb液体培养基中摇菌后涂板，在含有相同抗生素(50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平)的lb固体培养基上筛选阳性单克隆，用上述扩增引物(seqidno.2、seqidno.3)做菌落pcr鉴定阳性克隆，得到含有植物表达载体trv2-rcco的农杆菌gv3101；
s3：采用冻融法将trv1质粒转化农杆菌gv3101。具体步骤：用移液枪取3μl的trv1质粒轻轻加入冰上预先融化的含有50μl农杆菌gv3101的ep管中，然后迅速投入液氮中冷冻5min，然后取出ep管转入37℃的水浴锅中融化5分钟，再加入500μl的lb液体培养基后在28℃振荡培养器中以200rpm摇菌2h后涂板，在含50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平lb固体培养基上筛选阳性单克隆，得到含有trv1载体的农杆菌gv3101；将含有trv1载体的农杆菌gv3101和s2得到的含有植物表达载体trv2-rcco的农杆菌gv3101分别在28℃振荡培养器以200rpm在含有50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平的lb液体培养基中摇菌过夜至od600＝0.5,然后将菌液转移到离心管中以5000rpm离心10分钟，沉淀用转化液重新悬浮，所述转化液为ms液体基本培养基，调整od600＝0.4，将分别含有trv1和trv2-rcco质粒的转化液以体积比1：1等比例混合，得到trv1/trv2-rcco侵染液，备用；
s4：将s3制备得到的trv1/trv2-rcco侵染液添加溴酚蓝指示剂，真空渗透法转化s1制备的茎段，至茎段全部变蓝为止；
作为s4具体操作方法的一种选择，将s3制备的含有等比例的trv1/trv2-rcco侵染液200ml转移到500ml的烧杯中并添加1滴溴酚蓝指示剂，将烧杯放置到真空抽滤器中，然后将s1中所得茎段平切口朝下倒置在烧杯中，使菌液恰好浸泡到茎段的上部1/3-1/2的位置，打开真空泵真空抽滤5-10分钟，所用真空抽滤的压力为0.5mpa，看到茎段基部马蹄形切口变蓝为止。
作为s4具体操作方法的另一种选择，如果所用茎段数量不多，可以将茎段放置在50ml的医用注射器中，加入10-20ml侵染液，用手指封闭注射孔后反复抽拉手柄，观察到茎段的上下切口均变蓝为止。
s5：将s4侵染的茎段无菌水快速漂洗3次，按照马蹄形切口朝下的方向插入预先准备好的扦插基质中生根，所述扦插基质为蛭石:珍珠岩体积比5:1，基质穴盘上口封闭塑料盖保湿；在25℃，光照10000lux，每天光照16小时、黑暗8小时的培养条件下培养3-4周后，将生根的茎段转移到生长基质，所述生长基质为蛭石:草炭土:珍珠岩＝9:3:0.5，继续培养3-4周；
s6：以s5获得的转基因植株幼叶dna为模板，采用trv2质粒上的特异引物和目的基因rcco干扰片段的特异引物作为一对交叉引物，具体的，所述交叉引物f：tacggacgagtggacttagattct(seqidno.4)和r：accttctccatactgaactggtac(seqidno.5)对s5获得的转基因植株进行pcr筛选，筛选出具有清晰条带的样本确定为阳性转基因植株；阳性转基因植株幼叶提取rna，反转录合成cdna，设计rcco特异引物rcco-f：gatggttcaatttctcacactgtt(seqidno.6)和rcco-r：ggttggcatctgaattgtagg(seqidno.7)进行荧光定量pcr检测目的基因的表达量，对月季内源rcco表达量降低50％以上的阳性转基因植株确定为干扰株系，观测干扰株系开花时间，鉴定目的基因rcco在月季开花中的功能。
进一步的，s1所述月季为2年生月季品种月月粉，s4中所述真空渗透法具体步骤为将烧杯放置到真空抽滤器中，将s1所得茎段平切口朝下倒置在烧杯中，使添加溴酚蓝指示剂的trv1/trv2-rcco侵染液浸泡至茎段的1/3-1/2，0.5mpa压力真空抽滤5-10分钟，至茎段基部马蹄形切口变蓝为止；或将s1所得茎段放置在50ml的医用注射器中，加入10-20ml侵染液，用手指封闭注射孔后反复抽拉手柄，至茎段的上下切口均变蓝为止。
与正常对照相比，携带目的基因病毒载体的转基因植株的开花时间如明显延迟，则可以确定目的基因rcco是月季开花的促进因子，对维持月季正常开花是必需的；相反，与对照相比开花时间没有明显差异，则说明rcco基因与月季开花时间无关，或是无功能基因。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
(1)现有技术中，基于扦插技术结合trv病毒载体快速鉴定蔷薇科植物月季基因功能的研究未见报道。本发明将含有内源目的基因的trv2病毒沉默表达载体质粒，借助真空渗透法瞬时转化月季茎段，使月季内源目的基因发生沉默，扦插成活后鉴定表型，繁殖周期短、基因转化率高，无需进行植物遗传转化。
(2)本发明采用trv1/trv2-rcco等比例混合的侵染液侵染月季，其中trv1可以激活trv2在植株内的扩散，达到在整个植株水平沉默目的基因的效果，假阳性率低，基因表达时间长，当代可以鉴定基因沉默表型。
(3)利用本发明技术方案构建得到的病毒诱导的基因沉默体系，成本低，可快速鉴定基因功能，且具有高通量，易于操作与实现等优势，为大规模开展月季基因功能研究提供依据。
附图说明
图1采用交叉引物检测阳性转基因植株的pcr扩增产物电泳图；
图2干扰株系植株rcco基因表达量检测结果图；
图3干扰株系植株开花表型对比图。
具体实施方式
下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，在以下实施例中，除非特殊说明，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。具体实施方式如下：
实施例1
1、茎段准备：
取2年生大田生长的月季品种‘月月粉’植株上当年生长且尚未充分木质化的枝条，去掉顶部嫩梢和基部部分，将枝条剪成带2-3个芽的茎段，上切口平剪，下切口剪成马蹄形，用流动的自来水水冲洗30分钟后备用，每个转化事件至少需要准备50个茎段。
2、植物表达载体trv2-rcco的构建
采用ctab法提取月季总rna，并用takara的superscriptiiireversetranscriptase(大连)反转录试剂盒将其反转录为cdna，-20℃冰箱保存备用。以月季的cdna为模板,根据目的基因rcco的保守序列设计引物，引物预先添加kpni和xhoi酶切接头，以rcco特异引物rcco-kpni-f：gggtacctgaatccggtgaagaacagcaac(seqidno.2)和rcco-xhoi-r：cctcgagaccttctccatactgaactggtac(seqidno.3)进行pcr扩增，，pcr反应体系25μl，反应条件94℃2min,58℃30s，72℃0.5min，38个循环，72℃延伸5min。得到长度为243bp的rcco干扰片段扩增产物。
用内切酶kpni和xhoi双酶切rcco扩增产物和质粒trv2，双酶切体系40μl(包含2μg质粒dna，10xneb酶切缓冲液4μl，kpni和xhoi酶各2μl，然后加双蒸水使总体积达到40μl)，37℃酶切30min，得到rcco干扰片段酶切产物和线性化的trv2。
通过t4dna连接酶将rcco干扰片段酶切产物插入到trv2的多克隆位点，然后转化农杆菌dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中摇菌过夜，再在含有相同抗生素(50mg/l卡那霉素)的lb固体培养基上筛选阳性单克隆，用上述扩增引物(seqidno.2、seqidno.3)做菌落pcr鉴定阳性克隆并测序，将测序正确(seqidno.1所示)后的连接质粒trv2-rcco转化农杆菌gv3101，在含有50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平的lb液体培养基中摇菌后涂板，在含有相同抗生素(50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平)的lb固体培养基上筛选阳性单克隆，用上述扩增引物(seqidno.2、seqidno.3)做菌落pcr鉴定阳性克隆，得到含有植物表达载体trv2-rcco的农杆菌gv3101。
3、制备trv1/trv2-rcco侵染液
采用冻融法将trv1质粒转化农杆菌gv3101。具体步骤：用移液枪取3μl的trv1质粒轻轻加入冰上预先融化的含有50μl农杆菌gv3101的ep管中，然后迅速投入液氮中冷冻5min，然后取出ep管转入37℃的水浴锅中融化5分钟，再加入500μl的lb液体培养基后在28℃振荡培养器中以200rpm摇菌2h后涂板，在含有50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平的lb固体培养基上筛选阳性单克隆，得到含有trv1载体的农杆菌gv3101。将含有trv1载体的农杆菌gv3101和前述得到的含有植物表达载体trv2-rcco的农杆菌gv3101分别在28℃振荡培养器以200rpm在含有50mg/l卡那霉素和30mg/l利福平的lb液体培养基中摇菌过夜至od600＝0.5,然后将菌液转移到离心管中以5000rpm离心10分钟，沉淀用转化液重新悬浮，所述转化液为转化液为ms液体基本培养基，调整od600＝0.4，将分别含有trv1和trv2-rcco质粒的转化液以体积比1：1等比例混合，得到trv1/trv2-rcco侵染液，备用。
4、trv1/trv2-rcco侵染液瞬时转化月季茎段
取trv1/trv2-rcco侵染液200ml转移到500ml的烧杯中并添加1滴溴酚蓝指示剂，将烧杯放置到真空抽滤器中，然后将前述准备的50个月季茎段平切口朝下倒置在烧杯中，使菌液恰好浸泡到茎段的上部1/3-1/2的位置，打开真空泵0.5mpa真空抽滤5-10分钟，看到茎段基部马蹄形切口变蓝为止。
5、转化后月季茎段扦插生长
抽滤结束后，取出月季茎段，无菌水快速漂洗3次，按照马蹄形切口朝下的方向插入预先准备好的蛭石:珍珠岩体积比5:1的扦插基质中生根，基质穴盘上口封闭塑料盖保湿。
在25℃，光照10000lux，每天光照16小时、黑暗8小时的培养条件下培养4周，将生根的茎段转移到蛭石:草炭土:珍珠岩＝9:3:0.5的生长基质，继续培养3-4周。
6、荧光定量pcr检测rcco表达量
采用ctab法提取步骤5中获得的转基因月季植株幼叶dna，以转基因月季植株幼叶dna为模板，以采用trv2质粒上的特异引物和目的基因rcco干扰片段的特异引物作为一对交叉引物，f：tacggacgagtggacttagattct(seqidno.4)和r：
accttctccatactgaactggtac(seqidno.5)进行pcr筛选，pcr反应体系25μl，反应条件94℃2min,58℃30s，72℃0.5min，38个循环，72℃延伸5min。电泳筛选出具有清晰条带的样本确定为阳性转基因植株，即株系1，2，7，15，17-20，22-24(如图1所示)。
对阳性转基因植株幼叶采用ctab法提取月季总rna，并用takara的superscriptiiireversetranscriptase(大连)反转录试剂盒将其反转录为cdna，设计rcco特异引物rcco-f：gatggttcaatttctcacactgtt(seqidno.6)和rcco-r：ggttggcatctgaattgtagg(seqidno.7)进行荧光定量pcr检测目的基因的表达量，将月季内源rcco基因表达量降低50％以上的阳性转基因植株确定为干扰株系，具体样本为干扰株系-7，干扰株系-15和干扰株系-17(如图2所示)，进行表型分析，观测统计开花时间，鉴定目的基因rcco在月季开花中的功能。
干扰株系植株内源rcco基因表达水平降低，即内源rcco基因被沉默，其开花时间相对于空白对照植株明显延迟，(如图3所示)，可以确定目的基因rcco是‘月月粉’开花的促进因子，对维持月季正常开花是必需的。
综上所述，本发明构建了烟草脆裂病毒trv介导的rcco基因病毒诱导基因沉默载体，并转化感受态农杆菌，采用trv1/trv2-rcco等比例混合的侵染液侵染月季，假阳性率低，继而通过真空渗透法对月季进行了瞬时转化，诱导了月季内源rcco基因的沉默，实现病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明方法加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明附权利要所求的保护范围。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季开花基因功能的方法
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>243
<212>dna
<213>月季(rosahybrida)
<400>1
ctgaatccggtgaagaacagcaacggcaaccataacagtaacaacaatccaaataataac60
aacaacggtttcttcttcggagtggaggttgatgagtacttggattttgtggagtacaac120
tcatctgatcagaaccagctcagtacgactactgctagtactgaccagcataaccagtat180
ggtgtgccgcacaagatcagttatggaggtgatagtgttgtaccagttcagtatggagaa240
ggt243
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gggtacctgaatccggtgaagaacagcaac30
<210>3
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cctcgagaccttctccatactgaactggtac31
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tacggacgagtggacttagattct24
<210>5
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
accttctccatactgaactggtac24
<210>6
<211>0
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ggttggcatctgaattgtagg21