本发明属于细胞炎症模型技术领域，尤其涉及一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)是引起猪圆环病毒病(pcvd)和猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirus-associateddisease，pcvad)的主要病原。近年来，随着养猪业的发展，猪圆环病等传染性疾病的流行，给全球养猪业造成了严重的经济损失。pcv2病毒主要侵害动物体的单核-巨噬细胞和抗原提呈细胞，pcv2感染后可引起的淋巴滤泡破坏和白细胞减少症可以导致猪的免疫抑制病等。猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolarmacrophage，pam)是肺部免疫最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一，在猪执行天然免疫和特异性免疫时起重要功能。在生理条件下，肺泡巨噬细胞的主要作用是清除组织内细胞碎片等，主要发挥抑炎作用，但对于组织损伤或是致病微生物等，肺泡巨噬细胞需要启动强大的促炎反应以维持组织稳态。当肺部受到损伤或是感染时，肺泡巨噬细胞的促炎作用强于抑炎作用，肺泡巨噬细胞可以产生并释放大量的炎症介质，如细胞因子、趋化因子、补体、危险信号分子等。这些炎症介质中有些为趋化因子，可以招募单核细胞和中性粒细胞，或作为刺激剂激活肺上皮细胞和间质巨噬细胞，从而建立肺部炎症环境。
pcv2感染后，猪肺泡巨噬细胞作为pcv2的靶细胞，是首先抵御肺部损伤的重要免疫细胞。pcv2感染猪肺泡巨噬细胞的程度也是病猪的肺部损伤程度的一个重要参考。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，为研究pcv2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供较理想的体外模型。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系(3d4/2细胞)。
上述体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，包括以下步骤：
(1)3d4/2细胞经复苏传代后，待细胞达到一定数量后，细胞计数仪计数活细胞数>95％，调整细胞浓度备用；
(2)设置细胞对照组和不同浓度pcv2病毒感染组，加入dmem培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1ml含5％fbs的dmem培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于细胞活性及与细胞分泌炎性相关因子指标的测定，确定病毒最适孵育浓度和炎症最适孵育时间。
步骤(1)按以下操作进行：3d4/2细胞复苏后，用含10％-fbs-dmem培养液转入瓶中，于37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞长至70％-80％时进行传代，传代时用0.25％胰酶消化后以1∶2或者1∶3的比例进行传代培养，待细胞达到一定数量后，细胞计数仪计数活细胞数>95％，调整细胞浓度为1×106cell/ml备用。
步骤(2)按以下操作进行：分别设置细胞对照组和4个不同浓度pcv2病毒感染组，每组4个重复，按1000μl/孔加至24孔板内，培养过夜使细胞贴壁后弃去培养液，pbs缓冲液洗2次，细胞对照组加入无血清dmem培养液500μl，病毒组加入等量用不含血清的dmem培养液稀释的不同浓度病毒液，37℃、5％co2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液，pbs缓冲液清洗3次后每孔加入1ml含5％-fbs-dmem培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于后续指标测定。
pcv2病毒感染组分为4个不同浓度，分别是100、10-1、10-2、10-3pcv2。
指标包括细胞no分泌水平、ros(细胞内总活性氧)水平、gsh(还原型谷胱甘肽)含量、xod(黄嘌呤氧化酶活性)、mpo(髓过氧化物酶活性)、inos(诱生型一氧化氮合酶)活性及il-1β、il-6、tnf-α、il-10、ifn-γ、il-8、mcp-1、cox-1、cox-2等炎性因子水平。
针对猪圆环病毒2型感染缺乏可用体外炎症模型的问题，发明人首次使用猪圆环病毒2型(pcv2)作为诱因，建立了一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，即采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系(3d4/2细胞)。该模型构建成本低、实用性强、技术先进。应用本发明建立猪肺泡巨噬细胞炎症体外模型后，通过测定病毒感染后细胞活性、细胞分泌一氧化氮(·no)的水平、细胞内总活性氧(ros)水平、还原型谷胱甘肽(gsh)含量、黄嘌呤氧化酶(xod)活性、髓过氧化物酶(mpo)活性、诱生型一氧化氮合酶(inos)活性及il-1β、il-6、tnf-α、il-10、ifn-γ、il-8、mcp-1、cox-1、cox-2等炎性因子水平，可探讨pcv2病毒感染量、感染时间与细胞炎性因子水平及活性氧水平动态变化的相关性。因此，本发明为研究pcv2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为pcv2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。
与现有技术相比，本发明的猪肺泡巨噬细胞炎症模型的建立方法具有以下优点：
1、本发明首次使用猪圆环病毒2型(pcv2)作为诱因，建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型。
2、本发明确定了pcv2的最佳感染浓度(滴度为102.5tcid50/0.1ml)和孵育时间及猪肺泡巨噬细胞炎症最适孵育时间(4～24h)。
3、本发明首次使用il-1β、il-6、tnf-α、il-10、ifn-γ、il-8、mcp-1、cox-1、cox-2等炎性因子水平及细胞no分泌水平、ros水平、gsh、含量、xod、mpo、inos活性作为活性氧相关的炎症状态的相关评价指标。
4、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行pcv2诱导猪肺泡巨噬细胞炎症研究的人员较顺利的建立猪肺泡巨噬细胞活性氧相关的炎症模型。
附图说明
图1是pcv2感染对3d4/2细胞存活率的变化图。
图2是pcv2感染3d4/2细胞对no分泌的变化图。
图3是pcv2感染3d4/2细胞对ros水平的变化图。
图4是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌tnf-α的变化图。
图5是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌il-1β的变化图。
图6是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌il-6的变化图。
图7是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌il-8的变化图。
图8是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌il-10的变化图。
图9是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌inf-γ的变化图。
图10是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌mcp一1的变化图。
图11是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌cox-1的变化图。
图12是pcv2感染3d4/2细胞对细胞分泌cox-2的变化图。
图13是pcv2感染3d4/2细胞对细胞内xod活性的变化图。
图14是pcv2感染3d4/2细胞对细胞内mpo活性的变化图。
图15是pcv2感染3d4/2细胞对细胞内gsh含量的变化图。
图16是pcv2感染3d4/2细胞对细胞内inos活性的变化图
具体实施方式
一、实验方法
(1)3d4/2细胞的培养：3d4/2细胞复苏后用含10％胎牛血清的dmem培养液转入瓶中，于37℃、5％co2培养箱中培养。待细胞长至70％-80％时进行传代，传代时用0.25％胰酶消化后以1∶2或者1∶3的比例进行传代培养，待细胞达到一定数量后，细胞计数仪计数活细胞数>95％，调整细胞浓度为1×106/ml备用。
(2)分别设置细胞对照组和4个不同浓度pcv2病毒感染组(100、10-1、10-2、10-3)，每组4个重复，按1000μl/孔加至24孔板内，培养使细胞贴壁后弃去培养液，pbs缓冲液洗2次，细胞对照组加无血清dmem培养液500μl，病毒组加入等量不含血清dmem培养液稀释的不同浓度病毒液，37℃，5％co2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液，pbs缓冲液清洗3次后每孔加入1ml含5％-fbs-dmem培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于后续指标测定。
(3)细胞活性的测定：细胞浓度为1x105cell/ml，均匀铺于96孔板，100μl/孔。将培养板在培养箱预培养12小时。第二天弃去原培养液，用pbs缓冲液洗2次，细胞对照组加入无血清的dmem培养液100μl，病毒组加入等量的dmem培养液稀释的不同浓度病毒液，37℃，5％co2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液，pbs缓冲液清洗3次后，每孔加入100μl含5％-fbs-dmem培养液后继续培养。分别在第4、8、12、24、48h时间点后，每孔加入10μlcck8溶液，将培养板在培养箱内孵育1小时，吸光值0d450测定。
(4)griess法检测上清中no含量：细胞分别培养4h、8h、12h、24h后，取各孔上清各100μl，加入等量griess试剂，充分混匀，酶联免疫检测仪检测0d550nm，根据标准曲线回归方程计算no含量。
表1标准曲线的制作(单位：μl)
(5)dcfh-da荧光探针检测细胞内ros水平：细胞分别培养4h、8h、12h、24h、48h，弃上清，24孔板内每孔加入dcfh-da探针500μl，培养箱内避光孵育30min后0.01mpbs洗3次，再加入1000μlpbs，用细胞刮刀将细胞刮下，吹匀后，每孔取200μl于96孔黑板中，于荧光酶标仪测定其荧光值(激发波长488nm，发射波长525nm)。
(6)细胞内gsh含量及xod、mpo、inos活性的检测：细胞处理后，分别于4h、8h、12h、24h、48h后弃上清收集细胞，2000rpm×5min离心弃上清，pbs洗3次，再加入1000μlpbs，超声破碎，10000g×10min离心取上清液，用于gsh含量及xod、mpo、inos活性的检测。
(8)实验数据采用ssp21.0统计软件进行单因素方差分析(one-wayanova)，duncan组间比较，结果以
二、实验结果
〈a>不同浓度pcv2体外感染对3d4/2细胞活性的影响(图1)
图1显示pcv2原液感染3d4/2细胞8h、12h后细胞活性无明显改变，感染24h细胞活性增加，与细胞对照组相比差异不显著；其余各浓度的pcv2感染3d4/2后细胞活性均有一定程度改变，但与细胞对照组相比差异无统计学意义(p＞0.05)。
〈b>不同浓度pcv2体外感染3d4/2细胞对no分泌的影响(图2)
图2显示，100pcv2感染3d4/2细胞4h、8h、12h、24h促进细胞分泌no，且100pcv2感染3d4/2细胞8h、24h促进细胞分泌no水平升高，与细胞对照组比较存在显著性差异(p＜0.05)。
<c>不同浓度pcv2体外感染3d4/2细胞对ros产生的影响(图3)
图3显示，pcv2原液感染细胞4h、8h、12h、24h后均能升高细胞内ros水平，与细胞对照组比较存在极显著显著具有统计学意义(p＜0.01)；10-1pcv2感染3d4/2细胞8h、12h、24h均能升高细胞内ros水平，与细胞对照组比较存在显著性或者极显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。
<d>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞分泌tnf-α的影响(图4)
图4显示，与细胞对照组相比，100pcv2病毒组感染3d4/2细胞8h后显著升高tnf-α水平，感染12h后细胞分泌tnf-α水平极显著升高(p＜0.05，p＜0.01)。10-1pcv2、10-2pcv2、10-3pcv2病毒组感染3d4/2细胞12h后细胞分泌tnf-α水平升高，与细胞对照组相比差异极显著(p＜0.01)。
<e>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞分泌il-1p的影响(图5)
图5显示，100pcv2感染3d4/2细胞8h、12h、24h后细胞分泌il-1β水平升高，与细胞对照组相比差异不显著(p>0.05)；10-1pcv2感染3d4/2细胞8h、12h、24h促进细胞内分泌il-1β水平升高，且感染8h后细胞分泌il-1β水平与细胞对照组相比存在差异性显著(p＜0.05)。
<f>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞分泌il-1β的影响(图6)
图5显示，100pcv2感染3d4/2细胞4h、8h、24h后细胞分泌il-6水平升高，且感染8h与细胞对照组比较存在极显著差异(p＜0.05)；10-1pcv2感染3d4/2细4h、8h后细胞内分泌il-6水平升高，且感染4h与细胞对照组比差异显著(p＜0.05)。10-2pcv2感染3d4/2细12h后细胞内分泌il-6水平升高，与细胞对照组比差异显著(p＜0.05)。
<g>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞分泌il-8的影响(图7)
图7显示，100pcv2组感染3d4/2细胞后促进细胞分泌il-8水平升高，且感染3d4/2细24h后细胞分泌il-8水平升高，与细胞对照组相比差异显著(p＜0.05)。10-1pcv2组感染细胞4h后细胞内分泌il-8水平升高，与细胞对照组相比差有统计学意义(p＜0.05)；10-3pcv2感染3d4/2细胞4h后升高il-8水平升高，与细胞对照组相比差异极显著(p＜0.01)。
<h>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞分泌il-10的影响(图8)
图8显示，100pcv2感染3d4/2细4h后细胞内分泌il-10水平升高，与细胞对照组相比差异显著(p＜0.05)，感染细8h后细胞分泌il-10水平降低，与细胞对照组相比差异不显著。且10-1pcv2感染细胞8h分泌il-10水平降低与细胞对照组比较存在显著差异(p＜0.05)。
<i>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞泌ifn-γ的影响(图9)
图9显示，100pcv2病毒组感染3d4/2细胞4h、8h、12h后显著升高细胞分泌ifn-γ水平升高(p＜0.05)，与细胞对照组相比具有统计学意义；10-1pcv2、10-2pcv2病毒组感染3d4/2细4h后细胞内分泌ifn-γ水平升高，与细胞对照组相比差异显著(p＜0.05)；10-3pcv2病毒组感染4h细胞分泌ifn-γ水平升高，而12h后细胞分泌ifn-γ降低，与细胞对照组相比差异显著或极显著(p＜0.05，p＜0.01)。
<j>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞泌mcp-1的影响(图10)
图10显示，pcv2感染3d4/2细胞后促进细胞分泌mcp-1水平升高。100pcv2、10-2pcv2、10-3pcv2病毒组感染细胞后8h升高mcp-1水平，与细胞对照组相比差异显著或极显著(p＜0.05，p＜0.01)；100pcv2、10-1pcv2、10-2pcv2、10-3pcv2病毒组感染细胞后24h均促进细胞分泌mcp-1，与细胞对照组存在显著或极显著意义(p＜0.05，p＜0.01)。
<k>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞泌cox-1的影响(图11)
图11显示，pcv2病毒感染3d4/2细胞4h、8h、24h后细胞分泌cox-1水平升高，在感染第12h后分泌cox-1水平降低。与细胞对照组相比，100pcv2感染细胞8h、24h显著升高细胞分泌水平(p＜0.05)；10-1pcv2感染细胞4h、24h显著升高细胞分泌水平，而12h显著降低细胞分泌水平(p＜0.05)。10-2pcv2感染4h、8h细胞分泌cox-1水平升高，10-3pcv2感染4h细胞内分泌cox-1水平升高，与细胞对照组相比存在显著性差异(p＜0.05)。
<l>pcv2体外感染3d4/2细胞对细胞泌cox-2的影响(图12)
图12显示，100pcv2感染3d4/2细4h后细胞内分泌cox-2水平显著升高(p＜0.05)，感染8h后细胞分泌cox-2水平显著降低(p＜0.05)，随感染时间增加细胞内分泌cox-2水平逐渐升高，与细胞对照组相比差异不显著；10-1pcv2感染3d4/2细胞4h后显著升高细胞分泌cox-2水平，感染8h后细胞分泌cox-2水平显著降低(p＜0.05)；。
<m>不同浓度pcv2感染3d4/2胞对细胞xod活性的影响((图13)
图12显示，与细胞对照组相比，100pcv2病毒组感染3d4/2细胞4h、8h后升高细胞xod活性，与细胞对照组相比差异显著或者极显著(p＜0.05，p＜0.01)；10-1pcv2病毒组感染3d4/2细12h后细胞内xod活性极显著升高(p＜0.01)；10-2pcv2病毒组感染4h后细胞内xod活性显著升高(p＜0.05)；10-3pcv2病毒组感染3d4/2细胞12h后细胞内xod活性升高，差异极显著(p＜0.01)。
<n>不同浓度pcv2感染3d4/2细胞对细胞mpo活性的影响(图14)
图14显示，与细胞对照组相比，100pcv2病毒组感染3d4/2细胞4h、8h、12h、24h后显著或者极显著升高细胞内mpo活性(p＜0.05，p＜0.01)；10-1pcv2病毒组感染3d4/2细4h、8h、24h后细胞内mpo活性极显著升高(p＜0.01)；10-2pcv2病毒组感染3d4/2细胞12h、24h后细胞mpo活性升高，与细胞对照组相比差异显著或者极显著(p＜0.05，p＜0.01)。
<o>不同浓度pcv2感染3d4/2细胞对细胞gsh活性的影响(图15)
图15显示，100pcv2感染3d4/2细胞8h、12h降低细胞内gsh水平，且感染12h与照细胞对组比较差异有统计学意义(p＜0.05)；10-1pcv2、10-2pcv2病毒感染12h细胞内gsh活性减少，与照细胞对组比较差异显著(p＜0.05)；pcv2感染24h细胞gsh内活性略有升高，与细胞对照组相比差异无统计学意义。
<p>不同浓度pcv2感染3d4/2细胞对细胞inos活性的影响(图16)
图16显示，100pcv2病毒组感染3d4/2细胞4h、12h、24h后显著或者极显著升高细胞inos活性(p＜0.05，p＜0.01)，10-1pcv2病毒组感染3d4/2细24h后细胞内inos活性显著升高(p＜0.05)，10-2pcv2病毒组感染12h后细胞inos显著升高(p＜0.05)；10-3pcv2病毒组感染3d4/2细胞4h、12h后细胞内inos活性显著升高(p＜0.05)。
三、研究结论
在本实验研究中，pcv2与3d4/2细胞共同培养2h后，利用pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳观察pcv2特异性扩增条带。结果显示，病毒感染后8h～48h均检测到特异性条带，提示pcv2成功感染3d4/2细胞。为了探讨不同浓度的pcv2感染3d4/2细胞不同时间，对3d4/2细胞内细胞因子及炎性相关指标状态是否有影响，观察了pcv2感染3d4/2细胞后对细胞no、ros、il-1β、il-6、tnf-α、il-10、ifn-γ、il-8、mcp-1、cox-1、cox-2及6sh、mpo、xod、inos活性的影响。
结果表明，100pcv2感染3d4/2细胞8h后显著升高细胞分泌no水平、感染3d4/2细胞4h～24h显著升高细胞ros水平；100pcv2感染3d4/2细胞8h、12h显著升高细胞tnf-α水平；10-1pcv2感染3d4/2细胞4h、8h、12h显著升高细胞xod、mpo、inos活性，提示10-1pcv2能成功感染3d4/2细胞，且一定程度上改变了细胞细胞炎性因子分泌水平，诱导细胞产生炎症。
因此，本发明成功建立了猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞炎症模型，选择100pcv2作为该模型的感染剂量，感染时间确定为4h～24h。