一种生物硫醇荧光探针及其应用的制作方法

本发明提供了一种检测生物硫醇的荧光探针，属于荧光探针技术领域。

技术背景

生物硫醇在生物体中扮演着非常重要的作用。其中最重要的生物硫醇是半胱氨酸（cys）、同型半胱氨酸（hcy）和谷胱甘肽（gsh）。半胱氨酸（cys）在细胞内的含量为30-200μm。在生物生长发育的过程中，半胱氨酸（cys）的缺乏会导致生长迟缓、毛发色素脱失、肝脏和皮肤损伤以及脂肪的损失。同型半胱氨酸（hcy）的含量为5.0-13.9μm。同型半胱氨酸（hcy）含量的变化与阿尔兹海默病、心血管疾病以及骨质疏松等疾病密切相关。谷胱甘肽（gsh）是细胞内最富裕的硫醇，其含量为1-10mm，在维持细胞的氧化还原动态平衡中起着重要作用。因为生物硫醇重要的生物学作用，所以发展一种快速、灵敏、简便的检测生物硫醇的方法对于学术研究和潜在的疾病诊断非常重要。

目前检测生物硫醇方法有很多，如高效液相色谱法、质谱法、气相色谱法及电化学方法等等。然而这些方法具有操作复杂、仪器昂贵、检测时间长等缺点。为了克服上述涉及的问题，而荧光探针具有以下优点：高灵敏度、操作简单、检测时间短、低成本，以及能够实现对细胞和活体的实时可视化示踪，正好克服了传统检测方法所具有的缺陷。因此，基于荧光探针检测生物硫醇的技术受到广泛关注。在现有技术中，cn104119263a提供了一种基于花箐素的半胱氨酸荧光探针化合物，cn104447421a提供了一种基于2-羟基-6-乙酰基萘的半胱胱氨酸探针化合物，此两种化合物制备复杂，只能检测一种巯基氨基酸，且无法实现更低浓度的检测。因此，开发出能够用于同时检测活细胞和活体中生物硫醇的荧光探针成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明所述的一种检测生物硫醇的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构具有式所示的结构：

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本发明所述检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

在氮气保护、冰浴下，将化合物ⅱ与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶解于干燥的二氯甲烷中，然后加入三乙胺，室温搅拌过夜，反应结束，真空浓缩得到粗产物，经柱层层析得到化合物i：

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本发明所述的荧光探针可用于体外水溶液中的生物硫醇的同时检测。

进一步优选的，所述荧光探针用于在ph7.4的dmf与pbs缓冲液混合液中的生物硫醇的快速检测。以谷胱甘肽为例，检测限为1.77×10^-7mol/l。

进一步优选的，所述荧光探针用于在ph7.4的dmf与pbs缓冲液混合液中对生物硫醇具有特异性响应性能。本发明通过实验验证，所述荧光探针在ph7.4的dmso与pbs缓冲液混合液中以365nm波长的光源作为激发光，其溶液几乎不发光。随着生物硫醇的加入，溶液在365nm的光激发时，溶液在470nm处发出强烈的蓝色荧光。当加入其它非巯基氨基酸时荧光没有明显变化。因此，本发明的荧光探针化合物对生物硫醇具有很高的选择性。

本发明的荧光探针化合物在ph7.4的dmf与pbs缓冲液混合液中，随着生物硫醇浓度的增加而荧光增强，且荧光强度与生物硫醇的浓度具有线性关系，据此线性关系，可以定量测定溶液中生物硫醇的含量。

本发明所述的荧光探针可用于细胞内生物硫醇的同时检测。具体检测方法为：在37℃下，用10μm的化合物i的溶液孵育hela细胞，细胞无明显荧光。之后先在37℃下将hela细胞在10μm的化合物i的溶液培养，用pbs洗涤三次，更换培养基，再分别由含有谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸以及硫离子的缓冲溶液孵育，细胞发出强烈的荧光。实验表明，化合物i对细胞内的谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸和硫离子具有良好的成像作用，可以很好的用于检测细胞内的谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸以及硫离子，因此，本发明探针在生物医学等方面具有重要的潜在应用价值。

本发明的有益效果：

本发明所涉及的一种检测生物硫醇的荧光探针，具有以下优势：1、该探针能与生物硫醇特异性反应，导致该化合物的荧光强度得到很大的增强；2、该探针在检测生物硫醇过程中不会受到其他氨基酸的干扰，对生物硫醇具有良好的选择性；3、该探针能对活细胞中的生物硫醇进行检测，成像效果好，且细胞毒性低。

附图说明

图1是化合物i的¹hnmr谱图。

图2是化合物i的选择性荧光柱状图。

图3是化合物i随谷胱甘肽浓度变化的荧光光谱图。

图4是化合物i加入谷胱甘肽的响应时间光谱图。

图5是化合物i与谷胱甘肽的生物成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。

实施例1：探针化合物i的合成

在氮气保护、冰浴下，将0.25克化合物ⅱ与0.24克4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶解于20毫升干燥的二氯甲烷中，然后加入三乙胺，室温搅拌过夜，反应结束，真空浓缩得到粗产物，经柱层层析得到化合物i，收率为55％。图1为该探针的核磁氢谱图。

实施例2：探针化合物i的选择性实验

取实施例1制备的荧光探针化合物，溶解到含有dmf与pbs的混合液中，用pbs缓冲溶液调节溶液的ph=7.4；得10μm的荧光探针溶液，备用。

制备20份10μm的探针化合物i的dmf和pbs缓冲液的混合液，分别向其中加入10mm的干扰物k⁺，na⁺，ca²⁺，br^-，clo^-，f^-，h2o2，his，met，pro，lys，ser，thr，try，tyr，phy，hcy，cys，gsh,检测结果如图2。当激发光波长为365nm时,探针化合物i对谷胱甘肽在468nm出有强烈的荧光响应，而且探针化合物i对其他非巯基氨基酸没有明显响应，说明探针化合物i对谷胱甘肽具有优异的选择性。

实施例3：化合物i对生物硫醇的浓度变化响应分析

以谷胱甘肽为例。在含有不同浓度的谷胱甘肽（0-200μm）的缓冲液中加入10μm探针化合物i的溶液中，荧光响应强度随加入谷胱甘肽浓度的增加呈线型增加，检测结果如图3，结果说明探针化合物i对谷胱甘肽浓度检测范围较广且灵敏度较高。

实施例4：化合物i对生物硫醇响应时间分析

以谷胱甘肽为例。在含有生物硫醇的dmf和pbs缓冲液中加入10μm的探针化合物i，对探针化合物i与加入谷胱甘肽的响应时间进行了检测，结果如图4。在加入谷胱甘肽30分钟内，探针化合物i对谷胱甘肽的荧光响应强度随时间的增加呈线性增强，在15分钟内就能达到良好的荧光强度。结果表明，探针化合物i对谷胱甘肽的响应较快速，可应用于谷胱甘肽的检测。

实施例5：化合物i在细胞检测中的应用

以谷胱甘肽为例。在10μm的化合物i加入到hela细胞的培养液中，然后在37℃下培养，之后pbs洗涤，再加入谷胱甘肽，洗涤后成像，结果如图5。从图5可以看出，当以405nm的激光激发时，细胞发出明亮的蓝色荧光。因此，探针化合物i能用于检测细胞内的谷胱甘肽，在生物医学等方面具有重要的潜在应用价值。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，所述领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。