鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法与流程

本发明属于有益菌筛选技术领域，主要涉及一种鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法。

背景技术：

益生菌（probiotic）该词最早是起源于希腊语，是由lilly和sti11we11在1965年科学杂志上提出，“由一种微生物产生促进另一种微生物生长的物质”[15]。随着科学经济的迅猛发展和对益生菌知识的不断丰富，人们对益生菌又有了进一步的认知。1989年英国的fullerr将其定义为：益生菌是额外补充的活性微生物，能改善肠道菌群的动态平衡，对宿主的健康产生良好的作用。此后在2001年，世界联合国粮农组织（fao）和世界卫生组织（who）定义：益生菌（probiotics）是一种活的微生物，当以适当剂量服用时能够对宿主（人或动物）产生有益健康的作用。目前人们对益生菌公认的定义是：益生菌指的是一类对宿主有益的微生物，能够定值依附于人体肠道内，维持肠道菌群的动态平衡，起到健康的功效。益生菌能够促进人体对营养物质的消化吸收，可以预防和治疗人体腹泻，此外益生菌还可以缓解乳糖不耐症等多种功效。因此，如今越来越多的人开始选择服用益生菌产品，益生菌及其产品受到前所未有的关注。目前我们将已知的益生菌分为以下三大类，第一是乳杆菌类，第二是双歧杆菌类，第三种是革兰式阳性球菌类。在2010年，国家卫生部办公厅组织制定了《可用于食品的菌种名单》，其中包括21种益生菌。其中双歧杆菌属占6种，包括长双歧杆菌（bifidobacteriumlongum）、婴儿双歧杆菌（bifidobacteriuminfantis）两歧双歧杆菌（b.bifidum）等；乳杆菌属14种，包括副干酪乳杆菌（lactobacillusparacasei）、干酪乳杆菌（l.casei）、植物乳杆菌（l.plantarum）、鼠李糖杆菌（l.rhamnosus）、卷曲乳杆菌（lactobacilluscrispatus）等；此外还有嗜热链球菌（s.thermophilus）。

技术实现要素：

本发明的目的是，在于提供一种利用酵母细胞破碎液作为激活剂制备鼠李糖乳杆菌1.0320高密度菌液及包埋菌粉的方法。已发现的鼠李糖乳杆菌菌株，在生产过程中，营养要求苛刻，难以达到一定的密度，进而体现功能。鼠李糖乳杆菌1.0320为本实验室从传统马奶酒中获得一株具有高产细菌素、耐胆酸盐、高肠道粘附能力的鼠李糖乳杆菌。该菌所产细菌素对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc25923、大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922均具有显著抑菌效果。

本发明所提供的鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)1.0320株，是从传统马奶酒样品中分离出来的一株革兰氏阳性菌。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.15557，保藏日期为2018年04月08号。

一种鼠李糖乳杆菌高密度菌液的制备方法，其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌是保藏编号为cgmccno.15557的菌种，所述的制备方法包括如下步骤：

1）活化：从-80℃保存的鼠李糖乳杆菌的1.0320的菌种中挑取一部分并划线于固体mrs培养基中，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于mrs基础液体培养基中活化传代两次，培养12-16h菌液出现浑浊，取0.1ml的菌液在mrs固体培养基的平板上三区划线，置于37℃过夜培养，挑取单菌落革兰氏染色进行镜检，无杂菌污染，为合格；

2）发酵：发酵液配比为1%酵母粉，2%乳糖，4.5%~5%脱盐乳清粉，葡萄糖10%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.01%，用氨水调整ph为6.6；接种量2%，培养12h后，用氨水调整ph至6.3，加入1.2%酵母细胞破碎液，继续发酵4-12h，测定菌数10¹²cfu/ml以上，使用蒸汽灭菌的纳滤陶瓷膜过滤去除45%水分，得高密度鼠李糖乳杆菌菌液。

所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的纳滤的技术条件是：温度35℃，压力2.0mpa。

所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的酵母细胞破碎液采用以下方法制备：使用啤酒酵母发酵后，经生理盐水清洗，离心获得10⁶cfu/ml以上浓度的酵母细胞，超声破碎，55℃灭菌25分钟后备用。

一种利用上述鼠李糖乳杆菌高密度菌液制备包埋菌粉的方法，其特征在于：将以上步骤获得的高密度鼠李糖乳杆菌培养液，根据质量比依次加入1.5%海藻多糖，搅拌30分钟，加入0.2%植物油搅拌40分钟，加入β环装糊精3%，搅拌60分钟；所得浓缩液高压低温喷粉，获得包埋粉，其中，低温喷雾条件为：进风温度110℃，出风温度45℃。

本发明具有以下优点：

本制备方法简单，不改变现有发酵工序，容易操作；成本低，所用酵母菌粉相比其他水解微生物营养制剂成本低约3%左右；效率高，营养利用率及能量转换比例高；产物活性高，本株鼠李糖乳杆菌经本法发酵后，应用饲料生产中，能够起到部分替代抗生素的作用。

附图说明

图1是该乳杆菌生长过程中ph的变化。

图2是该乳杆菌对caco-2细胞的黏附作用。

具体实施方式

下面结合附图来对具体实施例来进一步描述。

实施实例1高密度菌液的生产

本方法制备的高密度菌液，可以直接用作食品或饲料的发酵剂。用于食品发酵，能够延长食品的保质期，避免杂菌污染；用于饲料发酵，能够减少饲料中抗生素的使用。

1）活化：从-80℃保存的鼠李糖乳杆菌的的菌种中挑取一部分并划线于固体mrs培养基中，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于mrs基础液体培养基中活化传代两次，培养12-16h菌液出现浑浊，取0.1ml的菌液在mrs固体培养基的平板上三区划线，置于37℃过夜培养，挑取单菌落革兰氏染色进行镜检，无杂菌污染，菌体形态丰满，为合格；

2）发酵：发酵液配比为1%乳糖，5%脱盐乳清粉，葡萄糖10%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.01%，用氨水调整ph为6.6；接种量2%，培养12h后，用氨水调整ph至6.3，加入1.2%酵母细胞破碎液，继续发酵8h，测定菌数10¹²cfu/ml以上，使用蒸汽灭菌的纳滤陶瓷膜过滤去除45%水分，得高密度鼠李糖乳杆菌菌液。

纳滤的技术条件是：温度35℃，压力2.0mpa。

酵母细胞破碎液采用以下方法制备：使用啤酒酵母发酵后，经生理盐水清洗，3500rmp/min以上离心获得10⁶cfu/ml以上浓度的酵母细胞。在55℃，25khz下，超声破碎10min。在经55℃灭菌25分钟。

2）保存和应用：经发酵获得的高密度菌液，按质量比1.5%加入海藻多糖，搅拌均匀后，-80℃快速冷冻保存。

所得的液体发酵剂或均属可达测定菌数10¹²cfu/ml以上，高于其他鼠李糖乳杆菌发酵剂浓度，发酵活力高，发酵过程中耐酸、耐胆盐，具有良好的肠道粘附能力，细菌素产量超过其他细菌15%以上。可以用于生产不添加防腐剂的食品，也可以用于生产目的在于减少抗生素使用的饲料。

实施实例2高密度菌粉的生产

实例1生产的高密度菌液，可以进一步加工成高密度菌粉，具体方法如下：

将从实例1获得的高密度鼠李糖乳杆菌培养液，根据质量比依次加入1.5%海藻多糖，搅拌30分钟，加入0.2%植物油搅拌40分钟，加入β环装糊精3%，搅拌60分钟；所得浓缩液高压低温喷粉，获得包埋粉，其中，低温喷雾条件为：进风温度110℃，出风温度45℃。

该乳杆菌生长过程中ph的变化如图1；该乳杆菌对caco-2细胞的黏附作用如图2。