本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种干细胞外泌体、制备方法及应用。
背景技术
msc是目前研究最多的干细胞，目前许多临床试验以证实msc能够治疗多种疾病，并且具有较好效果，同时msc具有更强的安全性，且在不同酸碱环境、缺氧、高温、反复冻融等恶劣条件下仍能保持较高稳定性，用其制成的功能性美容产品能够最大限度的保持细胞再生因子的活性和功能，现今干细胞外泌体护肤产品的研究已有很多，大都是利用其外泌体的活性使肌肤状况改善。
然而，肌肤问题多种多样，用户需求也多种多样，抗衰、美白、抗敏等等，但是造成肌肤问题的原因则是由许多因素，例如阳光暴露、空气污染、吸烟、酗酒、营养不良、不健康饮食、慢性疾病等环境性因素，另一种则是有我们自身的遗传基因调控，无论是衰老、黑色素沉积还是过敏性肌肤，与相关基因的表达活性有很大关系。
现今护肤品大都是从防护着手，改善或修复外部环境带来的损伤，无法从根源解决基因问题带来的肌肤问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种干细胞外泌体、制备方法及应用。
具体技术方案如下：
一种干细胞外泌体，其不同之处在于，所述干细胞外泌体由含有改善皮肤的靶基因载体的间充质干细胞分泌，所述靶基因载体包括kif3a、ovol1、sod1、col5a1、mc1r、tyr、ghrhr、edar、flg、mmp9、xrcc1、rad51、hbe1或kl中的一种或多种基因。
一种制备上述干细胞外泌体方法，其不同之处在于，首先对用户肌肤问题进行关于皮肤的基因检测，根据基因检测的结果，寻找到改善其肌肤问题的目的基因，通过体外合成手段对所述目的基因进行扩增，然后将目的基因转至载体制备成靶基因载体，将所述靶基因载体转染进间充质干细胞得到靶基因间充质干细胞，最后将所述靶基因间充质干细胞进行培养，收集其细胞培养液，提取所述细胞培养液中的外泌体，将提取好的外泌体进行灭菌、定量后分装保存；
所述测试的基因如下中的一种或多种基因组合：
与青春痘形成的相关基因组合：edar、cyp21a2、kif3a、ovol1、atp2a2；
皮肤防晒能力的相关基因组合：mc1r、oca2、sod1、cyp21a2、kif3a、ovol1；
皮肤抗敏性的相关基因组合：col5a1、mc1r、kif3a、ovol1、sod1；
与雀斑黑色素形成相关的基因组合：mc1r、oca2、bnc2、tyr；
抗皱能力的相关的基因组合：sod1、ghrhr、edar、flg、mc1r、mmp9；
与皮肤防辐射能力及抗衰老能力相关的基因组合：xrcc1、rad51、hbe1、mmp9、sod1、chrhr、kl。
上述技术方案中，所述目的基因包括kif3a、ovol1、sod1、col5a1、mc1r、tyr、ghrhr、edar、flg、mmp9、xrcc1、rad51、hbe1或kl中的一种或多种。
上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
(2)将所述目的基因进行扩增，并加入酶切位点，装入载体，得到靶基因载体，将所述靶基因载体转至步骤(1)所述间充质干细胞，得到靶基因间充质干细胞；
(3)将步骤(2)中选取的间充质干细胞使用ɑ-mem空培养基进行培养，培养一段时间后，去除杂质，分离出培养上清液；
(4)将步骤(3)所述培养上清液与totalexosomeisolation外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
(5)将步骤(4)所述含外泌体的浓缩液加入无菌pbs溶解后加入totalexosomeisolation外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得间充质干细胞分泌的外泌体。
上述技术方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞中的一种。
上述技术方案中，所述载体为质粒，所述靶基因载体转染方法为lipo2000转染法或电转法。
上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法步骤(3)通过以下步骤完成：
步骤3a:将不含外泌体血清的空白干细胞ɑ-mem培养基加入步骤(2)所述筛选的靶基因间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基；
3b：将步骤3a中所述条件培养基在4℃，2000g条件下离心30min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，即培养上清液。
上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法步骤(4)通过以下步骤完成：
步骤4a：将步骤3b中所述培养上清液与totalexosomeisolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育过夜，孵育后得到第一孵育液；
步骤4b：将步骤4a所得第一孵育液在4℃，10000g条件下离心60min,所得肉眼不可见的底部沉淀，即为含外泌体的浓缩液。
上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法步骤(5)通过以下步骤完成：
5a：将步骤4b中所述含外泌体的浓缩液用磷酸缓冲盐溶液(pbs)进行溶解，得到外泌体盐溶液；
5b:在步骤5a所述外泌体盐溶液中加入外泌体提取液，在4℃条件下孵育1小时至12小时,所述外泌体盐溶液与totalexosomeisolation外泌体提取液的体积比为2:1，孵育后得到第二孵育液；
5c：将步骤5b中所述第二孵育液在4℃，10000g条件下离心60min，所得下层肉眼不可见的沉淀即为间充质干细胞分泌的外泌体。
上述干细胞外泌体在护肤上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于从基因根源入手，修复问题基因从而有效改善肌肤问题，缓解“内部老化”，根据不同用户的肌肤问题进行精准护肤，从而达到更好的护肤效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例一
用户a：女，25岁，敏感性肌肤，常年出现红血丝，皮肤瘙痒的问题，首先利用基因测试对下列基因进行测试：
皮肤抗敏性的相关基因：col5a1、mc1r、kif3a、ovol1、sod1；
测试结果显示：用户acol5a1基因表达活性偏低导致皮肤厚度偏薄，同时kif3a、ovol1基因表达活性偏高导致皮肤过敏反应相较于常人严重。
目的基因筛选：col5a1、kif3a、ovol1及sod1，旨在增加皮肤厚度，增加皮肤光抗敏性和黑色素降解能力，进而提高皮肤的抵抗性。
按下列步骤制备针对用户a的干细胞外泌体：
间充质干细胞分离培养
1)用无菌瓶(200ml生理盐水+一支庆大霉素)取回新鲜脐带；
2)分离血管周围的沃顿胶(wharton’sjelly)，剪碎；
3)放入2mg/mlⅰ型胶原酶中(约15ml)；
4)加入200μl的双抗和200μl的两性霉素b，混合均匀后置于培养箱中(37℃)过夜；
5)约20ml/皿)，每皿加1ml添加剂，200μl的双抗和200μl的两性霉素b,置培养箱中培养；
6)根据培养状态适时适量换液，待细胞长满后传代培养。
间充质干细胞传代
1)细胞长满后(约1×107)进行传代培养至3～5代。
2)吸取皿中部分培养基至50ml离心管(3ml/皿)，剩余转至废液缸；
3)每皿加8ml生理盐水和2ml0.25％的胰酶(胰酶终浓度0.05％)；
4)混匀消化适量时间(一般1min左右)，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后加入培养基终止消化，每皿加3ml；
5)用移液管吹打皿底把细胞洗下来(一般5～6次)，然后收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min；
6)弃上清，加入培养基(含添加剂)混悬，按所需细胞密度稀释后转入皿中，每皿约18ml(16～20ml)；
7)放入培养箱中培养。
选用3～5传代脐带干细胞活性最好，其分泌的外泌体对肌肤的修复功能最佳。
目的基因载体构建
(1)合成目的基因col5a1、kif3a、ovol1及sod1基因；
(2)对目的片段扩增；
(3)dna电泳回收pcr产物；
(4)将上述基因片段装入puc质粒载体。
转化
1)取一支感受态，冰上融化半个小时，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀，在冰中放置30分钟；
2)水浴锅预热到42℃，热激90秒；
3)快速将管转移到冰浴中，冷却5分钟；
4)每管加600μl无抗性lb培养基，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45分钟复苏；
5)6000g离心2min，用100μllb重悬已转化的感受态细胞，然后转移到含抗性的lb琼脂培养基上；
6)用涂布涂匀直至液体被吸收；
7)倒置平皿，于37℃培养，16小时；
8)阳性克隆pcr鉴定；
9)通过安全的lipo2000转染法或电转法将带有靶基因的质粒转染干细胞中，使得干细胞变为阳性克隆细胞，进而表达外源基因的产物。
脐带间充质干细胞外泌体的提取及及纯化
1)选择细胞状态良好、增殖能力强的第3-5代人脐带间充质干细胞；
2)添加无血清培养基hylonemem空培养基培养24-48h，收集细胞上清液5ml；
3)2000g离心30min除去细胞碎片；
4)将离心后干细胞上清液移至超滤离心管中，加入1/2体积的invitogen公司totalexosomeisolation外泌体提取液，4℃条件下孵育过夜，得到第一孵化液；
5)第二天10000g，4℃离心60min，得到含外泌体的浓缩液；
6)将浓缩液用无菌pbs溶解后加入1/2体积的invitogen公司totalexosomeisolation外泌体提取液，4℃冰箱孵育1h，得到第二孵化液；
7)再次10000g，4℃离心60min，收集底部沉淀，0.22μl滤膜过滤除菌，bca蛋白定量分装在无菌西林瓶中-80℃冻存；
对比例1
其干细胞外泌体与实施例一干细胞外泌体相比，除接入了空白puc质粒，其余制备方法均相同。
皮肤测试实验：
干细胞外泌体与市场水光针对人面部皮肤改善；
实验步骤：实验之前先使用(cbs-807皮肤分析系统)选取另两个个与用户a皮肤肤质相差不大的年轻女性做对照试验，其中一人用洗面奶将皮肤清洗干净后，用无针注射泵将定制干细胞外泌体溶解液泵进面部皮肤上，呈t型全脸涂抹划开。另两人则一个使用泵进市场上的普通牌子水光针，一个则使用对比例1外泌体泵；用后2周、4周、2个月后用皮肤检测仪(cbs-807皮肤分析系统)检测皮肤的水分、弹性、皮肤厚度、红血丝及弹性情况。结果显示本发明干细胞外泌体相较于对比例1外泌体及水光针，其针对用户a过敏性肌肤情况有明显的改善效果。
实施例二
用户b：女，38岁，肌肤出现松弛，产生皱纹、干燥及色斑等问题，首先利用基因测试对下列基因进行测试。
与皮肤防辐射能力及抗衰老能力相关的基因：xrcc1、rad51、hbe1、mmp9、sod1、chrhr、kl。
与抗皱能力相关的基因组合：sod1、ghrhr、edar、flg、mc1r、mmp9。
与雀斑黑色素形成相关的基因组合：mc1r、oca2、bnc2、tyr；
测试结果显示：sod1、chrhr、mmp9、hbe1基因表达活性偏低，导致出现衰老皱纹状况，tyr基因表达活性不足，导致出现黑色素抑制能力不足。
目的基因筛选：选取sod1、chrhr、mmp9、hbe1基因作为外源基因移入间充质干细胞，旨在提高肌肤的抗衰老能力，改善现有的衰老状态。
按下列步骤制备针对用户b的干细胞外泌体
间充质干细胞分离培养
(1)用无菌瓶(200ml生理盐水+一支庆大霉素)取回新鲜脐带；
(2)分离血管周围的沃顿胶(wharton’sjelly)，剪碎；
(3)放入2mg/mlⅰ型胶原酶中(约15ml)；
(4)加入200μl的双抗和200μl的两性霉素b，混合均匀后置于培养箱中(37℃)过夜；
(5)约20ml/皿)，每皿加1ml添加剂，200μl的双抗和200μl的两性霉素b,置培养箱中培养；
(6)根据培养状态适时适量换液，待细胞长满后传代培养。
间充质干细胞传代
(1)细胞长满后(约1×107)进行传代培养至3～5代。
(2)吸取皿中部分培养基至50ml离心管(3ml/皿)，剩余转至废液缸；
(3)每皿加8ml生理盐水和2ml0.25％的胰酶(胰酶终浓度0.05％)；
(4)混匀消化适量时间(一般1min左右)，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后加入培养基终止消化，每皿加3ml；
(5)用移液管吹打皿底把细胞洗下来(一般5～6次)，然后收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min；
(6)弃上清，加入培养基(含添加剂)混悬，按所需细胞密度稀释后转入皿中，每皿约18ml(16～20ml)；
(7)放入培养箱中培养。
选用3～5传代脐带干细胞活性最好，其分泌的外泌体对肌肤的修复功能最佳。
目的基因载体构建
(1)合成目的基因sod1、chrhr、mmp9及hbe1；
(2)对目的片段扩增；
(3)dna电泳回收pcr产物；
(4)将上述基因片段装入pbr322质粒载体。
转化
(1)取一支感受态，冰上融化半个小时，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀，在冰中放置30分钟；
(2)水浴锅预热到42℃，热激90秒；
(3)快速将管转移到冰浴中，冷却5分钟；
(4)每管加600μl无抗性lb培养基，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45分钟复苏；
(5)6000g离心2min，用100μllb重悬已转化的感受态细胞，然后转移到含抗性的lb琼脂培养基上；
(6)用涂布涂匀直至液体被吸收；
(7)倒置平皿，于37℃培养，16小时；
(8)阳性克隆pcr鉴定；
(9)通过安全的lipo2000转染法或电转法将带有靶基因的质粒转染干细胞中，使得干细胞变为阳性克隆细胞，进而表达外源基因的产物。
脐带间充质干细胞外泌体的提取及纯化
(1)选择细胞状态良好、增殖能力强的第3-5代人脐带间充质干细胞；
(2)添加无血清培养基hylonemem空培养基培养24-48h，收集细胞上清液5ml；
(3)2000g离心30min除去细胞碎片；
(4)将离心后干细胞上清液移至超滤离心管中，加入1/2体积的invitogen公司totalexosomeisolation外泌体提取液，4℃条件下孵育过夜，得到第一孵化液；
(5)第二天10000g，4℃离心60min，得到含外泌体的浓缩液；
(6)将浓缩液用无菌pbs溶解后加入1/2体积的invitogen公司totalexosomeisolation外泌体提取液，4℃冰箱孵育1h，得到第二孵化液；
(7)再次10000g，4℃离心60min，收集底部沉淀，0.22μl滤膜过滤除菌，bca蛋白定量分装在无菌西林瓶中-80℃冻存。
对比例2
其干细胞外泌体与实施例二干细胞外泌体相比，除接入了空白pbr322质粒，其余制备方法均相同。
皮肤测试实验：
干细胞外泌体与市场水光针对人面部皮肤改善；
实验步骤：实验之前先使用(cbs-807皮肤分析系统)选取另两个个与用户b皮肤肤质相差不大的年轻女性做对照试验，其中一人用洗面奶将皮肤清洗干净后，用无针注射泵将定制干细胞外泌体溶解液泵进面部皮肤上，呈t型全脸涂抹划开。另两人则一个使用泵进市场上的普通牌子水光针，一个则使用对比例2外泌体泵；用后2周、4周、2个月后用皮肤检测仪(cbs-807皮肤分析系统)检测皮肤的水分、弹性、皱纹及色斑情况。本发明干细胞外泌体相较于对比例2外泌体及水光针，针对用户b肌肤衰老、色斑，实施例相较于对比例2及水光针有明显的改善效果。
这些实例的运用仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。