一种核酸提取与PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种核酸提取与pcr检测试剂盒。

背景技术：

实时荧光定量pcr技术已广泛应用于遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。由于血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规taqdna聚合酶将产生明显的抑制作用。因此，必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于pcr扩增。核酸提取是核酸检测第一步，也是分子生物学中关键方法之一。为下游核酸检测提供基础，提取质量和完整性直接影响临床研究或诊断。

一般核酸提取过程包括两步：样品的裂解和纯化。传统的提取试剂由于取得率相对较低，且步骤较为繁杂，给提取工作带来一定影响，难以得到合格核酸样品。磁珠法是近几年发展起来的核酸提取方式，提取的核酸纯度高、产量大。显然，传统方法操作步骤多、成本高、对样品的需要量较大且易于造成交叉污染，不利于客户快速提取纯化核酸样本。

另外，在目前核酸检测应用最广的实时荧光pcr技术中，试剂大都不是即用型的，造成pcr检测普遍存在操作复杂、费事、所需费用高等问题，使用前需要有复杂的配置工作，容易造成试验的误差甚至失败。不同人员操作也引起实验误差；某些试剂在常温下保存不稳定；不能做到一步法快速提取核酸；pcr检测试剂需要现场手动配置，多个步骤需要人工标记，各阶段的检测仪器独立，不利于全自动处理大量试验样本。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术中存在的以上缺陷，本发明提出了一种核酸提取与pcr检测试剂盒。该核酸提取与pcr检测试剂盒采用了直接提取并扩增反应检测临床样本中病毒核酸的实时荧光pcr反应体系，将待测样本加入裂解液实现核酸裂解与纯化，裂解纯化后的产物可以直接进行pcr检测，并以即用型的冻干粉试剂实现扩增反应与pcr检测，无需测前配制，检测彻底解决了依赖于纯化的核酸dna为模板进行pcr扩增这一瓶颈问题，适用样本包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液和粘液等多类型样本。

本发明提供一种核酸提取与pcr检测试剂盒，其特征在于，包括：裂解液试剂盒以及pcr管，裂解液试剂盒内盛放核酸裂解液，通过所述核酸裂解液的作用使病毒核酸释放出来；所述pcr管内放置直接用于荧光定量pcr测量的冷冻干粉pcr扩增体系试剂，所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂是以pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针以及冻干保护剂为原料通过冷冻干燥工艺制备的所得物；

所述pcr管的管身包括反应部、缓冲部以及密封管盖，所述缓冲部位于所述管身的上部，所述反应部位于所述管身的下部，缓冲部和反应部二者通过导管连通。

其中，所述核酸裂解液包括cuhcl、naoh、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、nacl、聚乙二醇辛基苯基醚、表面活性剂、苯酚、异戊醇。其中，cuhcl的浓度为5.6-5.85g/10ml；乙二胺四乙酸0.03-0.04g/10ml；三羟甲基氨基甲烷0.06-0.07g/10ml；nacl0.01-0.015g/10ml；聚乙二醇辛基苯基醚2%-10%（体积比例）；表面活性剂0.075-0.1%（体积比）；核酸裂解液中加入1%-2.5%（体积比例）的苯酚、异戊醇混合液，其中苯酚、异戊醇体积比20:1-25:1。

所述表面活性剂采用以下任意一种：十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基甲三胺、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸钠。

其中，所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂采用如下方式制备：将pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针与冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，冷冻干燥。

其中，所述冷冻干燥分为预冷冻、主要冷冻干燥、加强干燥三个阶段，第一阶段为预冷冻，缓慢降温至-35至-40摄氏度，降温时长大于1小时，并在该温度条件下保持2.5小时；第二阶段为主要冷冻干燥阶段，温度保持-15至-20摄氏度，保持5小时，其中气压保持在0.1mbar；第三阶段为加强干燥，温度保持15-25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar。

其中，制备所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂采用的冻干保护剂包括：甘露醇、聚乙二醇、麦芽糖、抗坏血酸以及聚乙烯吡咯烷酮。其中，甘露醇加入量3-5g/10ml；聚乙二醇加入量2.5-3g/10ml；麦芽糖加入量15-18g/10ml；抗坏血酸加入量0.4-0.6g/10ml；聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.5g/ml。

其中，以加入焦磷酸酶的去离子水配制所述冻干保护剂溶液。其中，焦硫酸酶的加入量为1.1-1.6g/10ml。

其中，制备所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂采用的pcr反应缓冲液包括：脱氧核糖核苷三磷酸、氯化镁。

其中，所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂中还包含过渡金属硫化物。

本发明增强了核酸裂解效用以及纯化程度，无需核酸沉淀，裂解液可以直接检测，以即用型的冻干粉试剂实现扩增反应与pcr检测，无需测前配制，检测彻底解决了依赖于纯化的核酸dna为模板进行pcr扩增这一瓶颈问题，适用样本包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液和粘液等多类型样本。

说明书附图

图1为本发明实施例的pcr管结构示意图。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步具体的说明。

本发明提供一种核酸提取与pcr检测试剂盒，该核酸提取与pcr检测试剂盒由裂解液试剂盒以及pcr管组成。裂解液试剂盒内盛放核酸裂解液，待测样本加入核酸裂解液之后，通过所述核酸裂解液的作用使病毒核酸释放出来，并实现纯化，样本加入核酸裂解液之后所得物可以直接加入到pcr管实现pcr检测。所述pcr管内放置直接用于荧光定量pcr测量的冷冻干粉pcr扩增体系试剂，所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂是以pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针以及冻干保护剂为原料通过冷冻干燥工艺制备的所得物。

（一）核酸裂解液

具体来说，所述核酸裂解液包括cuhcl、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、nacl、聚乙二醇辛基苯基醚、表面活性剂、苯酚、异戊醇。其中，cuhcl的浓度为5.6-5.85g/10ml，优选为5.75g/10ml。乙二胺四乙酸0.03-0.04g/10ml，优选0.038g/10ml。三羟甲基氨基甲烷0.06-0.07g/10ml，优选为0.062g/10ml。nacl0.01-0.015g/10ml，优选0.011g/10ml。聚乙二醇辛基苯基醚2%-10%（体积比例），优选为2.7%。表面活性剂可以采用以下任意一种或多种混合：十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基甲三胺、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸钠；表面活性剂0.075-0.1%（体积比），优选0.85%。核酸裂解液中加入1%-2.5%（体积比例）的苯酚、异戊醇混合液，其中苯酚、异戊醇体积比20:1-25:1。裂解液ph值为4-4.5。为了实现核酸裂解所得产物后续的直接pcr检测，本发明的裂解液可产生高纯度和高完整性的核酸产物，将细胞中的蛋白质、多糖等成分完全移除，并且试剂无残留，无荧光抑制效应，保留核酸分子本身碱基序列的完整性。本发明实现裂解过程中，cuhcl与nacl混合溶液提供促进核酸裂解释放的环境，保护核酸不被核酸酶降解的效果突出；表面活性剂与蛋白质、多糖形成难溶性沉淀物，实现杂质与核酸的分离；苯酚、异戊醇进一步促进蛋白质与核酸成分的分离，其中苯酚使蛋白质成分变性，变性的蛋白质保留在有机相，而核酸保留为水相，而异戊醇促进有机相与水相分离；裂解液不含乙醇、异丙醇等核酸沉淀成分，因此核酸成分保持在裂解液中，可以直接进行pcr检测。其中，cuhcl、nacl、表面活性剂、苯酚、异戊醇的浓度以及裂解液ph值都基于实验进行了优化，从而实现核酸提取产量的最大化。

下面具体介绍依据本发明实现的裂解液实施例1-3及其实验效果。

实施例1：

按照本发明的方案配制核酸裂解液40ml，其中包括cuhcl5.6g/10ml，乙二胺四乙酸0.03g/10ml，三羟甲基氨基甲烷0.06g/10ml，nacl0.01g/10ml，聚乙二醇辛基苯基醚2%（体积比例），表面活性剂可以采用十二烷基硫酸钠，表面活性剂0.075%（体积比），1%（体积比例）的苯酚、异戊醇混合液，其中苯酚、异戊醇体积比20:1，调节裂解液ph值为4。

实施例2

按照本发明的方案配制核酸裂解液40ml，其中包括cuhcl5.85g/10ml，乙二胺四乙酸0.04g/10ml，三羟甲基氨基甲烷0.07g/10ml，nacl0.015g/10ml，聚乙二醇辛基苯基醚10%（体积比例），表面活性剂可以采用聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸钠混合，表面活性剂0.1%（体积比），2.5%（体积比例）的苯酚、异戊醇混合液，其中苯酚、异戊醇体积比25:1，调节裂解液ph值为4.5。

实施例3

按照本发明的方案配制核酸裂解液40ml，其中包括cuhcl5.75g/10ml，乙二胺四乙酸0.038g/10ml，三羟甲基氨基甲烷0.062g/10ml，nacl0.011g/10ml，聚乙二醇辛基苯基醚为2.7%（体积比），表面活性剂采用溴化十六烷基甲三胺，表面活性剂0.85%（体积比），核酸裂解液中加入2.5%（体积比例）的苯酚、异戊醇混合液，其中苯酚、异戊醇体积比22:1，调节裂解液ph值为4。

取上述三个实施例的核酸裂解液各0.5ml，并取病毒血浆样本0.1ml，将样本与裂解液混合至离心管，将离心管倒转3-5次，使核酸实现充分裂解释放。利用nanodrop1000微量核酸测定仪测量充分反应后裂解液中的核酸提取物产量如下：实施例1为12.3μg，实施例2为11.7μg，实施例3为14.8μg，可见核酸裂解产出效果好，且裂解液核酸浓度可以用于pcr直接测量。

（二）冷冻干粉pcr扩增体系

所述pcr管内放置直接用于荧光定量pcr测量的冷冻干粉pcr扩增体系试剂，将待测样本加入裂解液并充分裂解后所得的液相产物以及去rna水直接加入该pcr管实现扩增与pcr荧光测试。

所述pcr管的管身如图1所示，包括反应部101、缓冲部102以及密封管盖103，所述缓冲部102位于所述管身的上部，所述反应部101位于所述管身的下部，缓冲部和反应部二者通过导管104连通。在测试过程中，需要将裂解液加入该pcr管，裂解液先储存在所述缓冲部，然后经所述导管逐渐进入反应部，与冷冻干粉pcr扩增体系进行反应，可以提高反应效率。

所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂采用如下方式制备：将pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针与冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，分三个阶段进行冷冻干燥。其中，第一阶段为预冷冻，缓慢降温至-35至-40摄氏度，降温时长大于1小时，并在该温度条件下保持2.5小时；第二阶段为冷冻干燥阶段，温度保持-15至-20摄氏度，保持5小时，其中气压保持在0.1mbar；第三阶段为加强干燥，温度保持15-25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar。其中，冻干保护剂的作用是在冻干过程中保持pcr反应所需酶的活性，制备所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂采用的冻干保护剂包括：甘露醇、聚乙二醇、麦芽糖、抗坏血酸以及聚乙烯吡咯烷酮；以加入焦磷酸酶的去离子水配制上述成分作为所述冻干保护剂溶液。其中，甘露醇加入量3-5g/10ml；聚乙二醇加入量2.5-3g/10ml；麦芽糖加入量15-18g/10ml，优选16.4g/10ml；抗坏血酸加入量0.4-0.6g/10ml；聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.5g/ml。焦硫酸酶的加入量为1.1-1.6g/10ml。甘露醇和聚乙二醇混合作为赋形剂具有良好的效果，保持冷冻干粉的粘度，避免表面疏松。麦芽糖、抗坏血酸以及聚乙烯吡咯烷酮作为混合型保护剂，能够在冻干过程中替代流失的水和蛋白质组成氢键，起到保护作用，保持蛋白质活性。其中，作为优选方案，制备所述冷冻干粉pcr扩增体系的试剂中还包含过渡金属硫化物mos2，加入量为55μg/10ml，可以提升检测的灵敏度和特异性。并且，制备所述冷冻干粉pcr扩增体系试剂采用的pcr反应缓冲液包括：脱氧核糖核苷三磷酸、氯化镁，其有利于扩增效果的实现。

下面具体介绍依据本发明实现的冷冻干粉pcr扩增体系试剂1-3及其实验效果。

实施例1

配制冻干保护剂溶液10ml，具体成分如下：甘露醇加入量3g/10ml，聚乙二醇加入量2.5g/10ml；麦芽糖加入量15g/10ml，抗坏血酸加入量0.4g/10ml，聚乙烯吡咯烷酮0.8g/ml，焦硫酸酶1.1g/10ml。将pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针与上述冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，分三个阶段进行冷冻干燥。其中，第一阶段为预冷冻，缓慢降温至-35至-40摄氏度，降温时长大于1小时，并在该温度条件下保持2.5小时；第二阶段为主要冷冻干燥阶段，温度保持-15至-20摄氏度，保持5小时，其中气压保持在0.1mbar；第三阶段为加强干燥，温度保持15-25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar。

实施例2

配制冻干保护剂溶液10ml，具体成分如下：甘露醇加入量5g/10ml，聚乙二醇加入量3g/10ml；麦芽糖加入量18g/10ml，抗坏血酸加入量0.6g/10ml，聚乙烯吡咯烷酮1.5g/ml，焦硫酸酶1.6g/10ml。将脱氧核糖核苷三磷酸、氯化镁混合的pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针与上述冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，分三个阶段进行冷冻干燥。其中，第一阶段为预冷冻，缓慢降温至-35至-40摄氏度，降温时长大于1小时，并在该温度条件下保持2.5小时；第二阶段为冷冻干燥阶段，温度保持-15至-20摄氏度，保持5小时，其中气压保持在0.1mbar；第三阶段为加强干燥，温度保持15-25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar。

实施例3

配制冻干保护剂溶液10ml，具体成分如下：甘露醇加入量4.5g/10ml，聚乙二醇加入量2.8g/10ml；麦芽糖加入量16.5g/10ml，抗坏血酸加入量0.55g/10ml，聚乙烯吡咯烷酮1.1g/ml，焦硫酸酶1.35g/10ml。将pcr反应缓冲液、dna聚合酶、反应特异性引物、探针与上述冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，分三个阶段进行冷冻干燥。其中，第一阶段为预冷冻，缓慢降温至-35至-40摄氏度，降温时长大于1小时，并在该温度条件下保持2.5小时；第二阶段为冷冻干燥阶段，温度保持-15至-20摄氏度，保持5小时，其中气压保持在0.1mbar；第三阶段为加强干燥，温度保持15-25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar。

将以上三个实施例制备的冷冻干粉pcr扩增体系试剂各自分为5份，在37摄氏度环境下放置0、3、7、10、20天，然后加样裂解液实施例1-3制得的测试剂，震荡混匀，离心后上机进行pcr测试，实施例1-实施例3在0、3、7、10天的测试灵敏度均为10⁴，20天灵敏度为10⁵。可见能够较长时间保持测试灵敏度。

可见，本发明增强了核酸裂解效用以及纯化程度，无需核酸沉淀，裂解液可以直接检测，以即用型的冻干粉试剂实现扩增反应与pcr检测，无需测前配制，检测彻底解决了依赖于纯化的核酸dna为模板进行pcr扩增这一瓶颈问题，适用样本包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液和粘液等多类型样本。

以上实施例仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。