本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速提取土壤微生物dna的提取方法。
背景技术：
由于污水灌溉、粪便施肥以及医院废水排放等工农业生产，使得土壤中微生物污染形势日益严峻。因此对土壤污染微生物的检测工作显得尤为重要。基于pcr技术的土壤微生物多样性分析可以鉴定土壤中微生物的种类和含量。但由于农田土壤使用各种肥料以及秸秆还田，土壤有机质含量较高，腐植酸也较多,因此从土壤中提取的微生物总dna中常有一定的腐植酸污染。腐植酸对pcr扩增有较大影响,少量的腐植酸会抑制dna聚合酶的活性,使得pcr扩增无法进行。因此，提取土壤总dna在避免蛋白质、rna污染的同时,如何尽可能地降低腐植酸的污染，从而获得高质量的土壤微生物dna是进行土壤微生物污染鉴定的核心和基础。
目前常用的土壤dna提取方法如采用化学方法裂解细胞,辅之以酶处理等方法：具体步骤为采用dna提取液(tris-hci,edta,磷酸钠，nacl,ctab)混合,再加入蛋白酶k及sds,225r/min摇床上37℃摇动30min,接着加入65℃水浴2h,收集上清,转移到50ml离心管中。重复上述操作,收集三次上清液合并。上清液与等体积的氯仿、异戊醇混合液(v(氯仿)∶v(异戊醇)＝24∶1)混合,离心,以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1h,室温12000r/min离心20min,收集核酸沉淀,用70％乙醇洗涤沉淀,溶解dna。该方法的缺点在于实验耗时长，实验步骤繁琐，而且在处理土壤中大量存在的腐殖酸方面效果不佳。而在去除腐殖酸方面，也有mobio公司开发的dna提取试剂盒:具体方法见实施例1。该方法实验步骤繁琐，dna在提取过程中损失量较大。有文献报道采用该方法的dna提取量为10.5μg/g(干土)，dna提取浓度比采用化学裂解法的23.5μg/g(干土)较低，而且试剂盒的价格比较昂贵(1600元/50次)，不适合较大规模的土壤样品检测。
技术实现要素：
本发明的目的为解决现有土壤微生物dna提取过程中面临的国外试剂盒价格昂贵，国内方法效果不佳的问题，提供了一种高效、经济的土壤微生物dna提取方法。该方法通过在腐殖酸吸附剂的成分中加入纳米tio2和活性炭和玻璃珠，在增强细胞破碎效果的同时利用其对腐殖酸有良好的吸附效果，可以避免过柱洗脱过程。本发明有效降低了成本，省时省力。
本发明由如下技术方案实现的：
一种高效经济的土壤微生物dna提取方法，包括如下步骤：
步骤一：获取微生物悬液；称取1克土壤,加入2ml悬浮缓冲液bufferc1，并加入1克粒径0.09-0.12mm的玻璃珠,加入500μl的腐殖酸吸附剂bufferc2，加入10μl蛋白酶k(10mg/ml)，混合后震荡10min；
步骤二：获取微生物dna；将步骤一所得溶液再加入裂解液2ml的bufferc3并涡旋振荡20～30s；
步骤三：获取粗制dna；将上步得到的物质搅拌下置于60℃下水浴20～30min,然后4℃条件下高速离心,收集第一上清液；
步骤四：获取精制dna；将步骤三所得第一上清液与等体积的bufferc4混合,高速离心15-20min,然后吸取水相转移至离心管中,加入与吸取的水相等体积的bufferc5,高速离心10-15min,得到第二上清液；以0.6倍第二上清液体积的bufferc6，在-20℃条件下沉淀30-45min,4℃高速离心20-30min,收集核酸沉淀,分别用在-20℃预冷的wb1和wb2依次洗涤沉淀,最后用te溶液溶解沉淀,得到含有土壤微生物dna的溶液。
所述的bufferc1试剂为：浓度为0.10～0.30mol/l磷酸钠溶液。
所述的bufferc2试剂的制备方法，包括以下步骤：称取3.2000g光谱纯二氧化钛于容器中,加入12.8g硫酸铵,32ml硫酸,并称取0.2g活性炭，加热至溶解，冷却至室温,加水稀释至200ml,摇匀,备用。
所述的bufferc3试剂为含有2％ctab(十六烷基三甲基溴化铵)、1.4mnacl、0.02medta(乙二胺四乙酸)、0.1mtris-cl(三羟甲基氨基甲烷的氯化氢缓冲溶液)、0.2％巯基乙醇和20％sds的水溶液。
所述的bufferc4试剂的组成为酚、氯仿和异戊醇，体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1。
所述的bufferc5试剂的组成为氯仿和异戊醇，其中体积比氯仿：异戊醇＝24：1。
所述的bufferc6试剂为异丙醇。
wb1试剂为纯度95％的乙醇；所述的wb2试剂为纯度75％乙醇。
所述的步骤三和步骤四中的高速离心为10000-12000r/min。
所述的bufferc4试剂中的酚具体为苯酚。
所述的te缓冲液为公知物质，为tris和edta的混和液。
本发明涉及物料的量，均可以整体放大或缩小，都属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果为：
采用本发明所述提取方法进行土壤微生物dna提取，利用专门研制的含有纳米tio2:0.2m；活性炭：0.1％的腐殖酸吸附剂能有效的吸附和去除土壤中的腐殖酸，大大提高dna的提取质量，另外加入玻璃珠可以增强细胞破碎效果，所提取的dna浓度得到了很大的提高，比采用原试剂盒的提取方法所提取的dna浓度提高了38.2％，且并不需要通过柱子吸附和洗脱，减少了试剂的使用量，且简化dna收集过程，缩短了实验时间，节省了试剂用量，因此本发明所述提取方法对dna的提取效率更高，更省时省力，也更经济合算。
本发明不仅操作简单，节省实验时间，提取的dna在浓度上了也有较大提高，比采用原试剂盒方法提取的dna浓度最高分别提高了30.9％、48.1％，dna纯度无明显变化。
因此，本发明为一种立足于土壤污染微生物检测的需要，能从土壤、粪便等复杂环境样品中提取不含抑制因子的、提取速度快、分析结果准确、具有市场可开发前景的土壤污染微生物dna的试剂盒。
具体实施方式
土样取自于天津市静海县普通小麦田，这些土壤长期种植小麦,施化肥和农家肥,秸秆全部还田,实行小麦、玉米轮作制度。农田土壤类型均为褐土,采样深度为表层土下10～20cm,按5点取样法,混匀放入无菌容器中,-20℃保存。采用三种方法同时进行dna提取实验，具体提取方法为：
实施例1(三次重复)
采用mobio公司的土壤提取试剂盒soildnaisolationkit进行提取,方法如下：
加2g土壤到15mlbeadtube中,加入0.25mlsr1和0.8mlsr2，加入2.5mlbeadsolutior到beadtube,再加入3.5ml酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1到试管中，加盖后涡旋混合直到分层消失。最大转速涡旋震荡15min，室温，2500g离心10min。取出后，小心地转移上层水相到干净的15ml收集管中，弃掉下层酚。加1.5mlsr3到水相中，然后祸旋混匀，4℃孵育10min，室温,2500g离心10min。转移上清到一个新的15ml收集管中，加入5mlsr4溶液到装有上清的收集管中，混匀室温孵育30min。室温，2500g离心30min。倒掉上清，将收集管倒置在纸上5min。震荡sr5混合。加1mlsr5到15ml收集管中，并反复吹打使完全重悬。为每一个rna样品推备一个rnacapturecolumn拿去15ml收集管的盖子，将rnacapturecolumn放入15ml收集管中。加2mlsr5到rnacapturecolumn中，让其完全流尽。从之前步骤加入rna样品至rnacapturecolumr中，然后让其在重力作用下流尽。收集液体。用1mlsr5清洗柱子。重力流尽，收集洗脱液。转移柱子到新的收集管，加入sr6震荡混合，然后加入1mlsr6到rnacapturecolumn。洗脱rna到15ml收集管中，重力流尽。转移洗脱的rna到2.2ml收集管中，并且加入1mlsr4.颠倒至少一次混合，然后-20℃孵育最少10min。室温,13000g离心15min浓缩rna。倒掉上清并倒转收集管在纸上10min晾干。用100μlsr7溶液重悬rna沉淀，去除其中的基因组。(更具体步骤详见其使用说明)
实施例2(当前使用的冷融法)
取1g经研磨的土壤粉末,置10ml离心管中,加2ml磷酸钠缓冲液(0.12mol/l,ph8.0),混合,放30℃摇床上,150r/min,摇动15min。8000r/min,离心10min。取沉淀,重复上述操作。取沉淀,加裂解液ⅰ(0.15mol/lnacl,0.1mol/ledta,ph8.0)1.5ml和50mg/l的溶菌酶0.5ml,混匀,37℃水浴2h,每20～30min摇一下。加裂解液ⅱ(0.1mol/lnacl,0.5mol/ltris-hcl,ph8.0,10％sds)2ml,反复冻融3次,8000r/min,离心15min。取上清液与等体积酚试剂(v(苯酚)∶v(氯仿)∶v(异戊醇)＝25∶24∶1)混合,8000r/min,离心10min。重复上一步操作。取水相与等体积氯仿、异戊醇混合液(v(氯仿∶v(异戊醇)＝24∶1)混合,8000r/min,离心10min。取水相,加0.6倍体积的异丙醇,-20℃冰箱过夜,10000r/min,离心20min,弃上清液。用70％乙醇洗沉淀,收集沉淀溶解于ph8.0的te缓冲液,终体积100μl。
实施例3
称取1克土壤,加入2ml悬浮缓冲液(磷酸钠水溶液，0.15mol/l,ph8.0)，1克粒径0.1mm玻璃珠放入提取管中,在玻璃珠的摩擦作用下，裂解土壤中的所有生物包括g+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫甚至真细菌的孢子、芽孢、动植物遗体等的游离dna；加入腐殖酸吸附剂500μl：其组成为含有纳米tio2:0.2m；活性炭：0.1％(质量百分比)。具体配置过程为：称取3.2000g光谱纯二氧化钛于容器中,加入12.8g硫酸铵,32ml98％硫酸并称取0.2g活性炭，加热至溶解，冷却至室温,加水稀释至200ml,摇匀,备用。)混合充分震荡1min；加入10μl蛋白酶k(10mg/ml)溶液,混合后震荡10min，再加入高效的裂解液2ml(2％ctab(质量百分比)，1.4mnacl，0.02medta,0.1mtris-cl，0.2％(体积百分比)巯基乙醇，20％sds(质量百分比))并涡旋震荡30s(旋涡震荡器转速为1000rpm)，在玻璃珠的摩擦作用下，裂解土壤中所有生物的dna。充分混匀后置于60℃水浴30min,期间不时摇匀。4℃，12000r/min离心10min,收集上清液,与等体积的bufferc4混合(苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)),12000r/min离心15min,吸取水相800μl转移至5ml离心管中,加入800μl的bufferc5(即氯仿：异戊醇(体积比24：1))12000r/min离心15min,收集上清液600μl，以其0.6倍体积的异丙醇室温沉淀30min,4℃12000r/min离心20min,收集核酸沉淀,用-20℃预冷的95％(体积比)乙醇洗涤沉淀1次，再同温度的75％(体积比)的乙醇再洗涤沉淀一次。用te缓冲液(tris和edta的混和液)溶解沉淀,最终得到体积为50μl的含有土壤微生物dna的溶液。
表1.提取土壤dna的方法比较
采用上述实施例1、实施例2和实施例3所述方法提取dna，经核酸蛋白测定仪(eppendorfbiophotometerd30)检测，其dna浓度最高分别为13.8μg/ml、20.7μg/ml、30.8μg/ml，a260/a280比值分别为1.73、1.59、1.814。由实验结果可知，本发明采用的实施例3所述方(备注)：方法1-3各重复三次，每次数据基本稳定，以证明实验没有误差。
法提取的dna在浓度上了有较大提高，比采用试剂盒方法和冻融法提取的dna浓度分别提高了1.23倍和48.8％，dna纯度无明显变化。考虑到在试剂使用量上的变化，优选实施例3所述方法，其dna提取效率更高，更省时省力、更经济合算。
由实验结果可知，采用本发明实施例3所述方法进行实验操作，不仅操作简单，节省实验时间，提取的dna在浓度上了也有较大提高，比采用原试剂盒方法提取的dna浓度最高分别提高了30.9％、48.1％，dna纯度无明显变化。其dna提取效率更高，更省时省力、也更经济合算。
实施例4,
其他步骤同实施例3，不同之处为土壤样本为工厂污水排污口附件的土壤，并且玻璃珠的直径为0.12mm。得到的土壤微生物dna含量经过与实施例3相同的测试，效果接近。
实施例5
其他步骤同实施例3，不同之处为土壤样本为医院废弃物堆放附近的土壤。得到的土壤微生物dna含量经过与实施例3相同的测试，效果接近。
本发明未尽事宜为公知技术。