一种具有杀菌作用的纳米簇及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种水溶性交联纳米聚合物，具体地说是一种具有杀菌作用的纳米簇及其制备方法和应用。

背景技术：

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏染色阳性球形细菌，显微镜下排列成葡萄串状，是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道粘膜。美国疾病控制中心报告，由金葡菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金葡菌是引起严重感染的一种致病菌，可在人体不同位点引发感染，从表皮的轻微感染到深度、致命性的感染，如肺炎、心内膜炎、败血病、骨髓炎和其他转移性并发症等。

纳米颗粒是1-200nm间的纳米颗粒。主要在生物技术，生物工程，纺织工程等方面用作抗菌。纳米粒子粒径小，比表面积高，能够快速在细胞膜表面吸附，显著的改变细菌的渗透性和呼吸功能等生理功能，导致细菌死亡，然而纯粹的无机纳米(以银纳米为例)具有较高的杀菌效率和杀菌范围广的优势，但是其生物毒性大，纯粹的纳米簇，具有较好的物理和化学稳定性，毒性低，但是杀菌效率低，杀菌范围窄且易产生耐药性，聚合物和纳米簇结合，可有效结合两者优势避免劣势，具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

基于以上技术和背景，本发明针对现有抗菌材料的不足，提供了一种具有杀菌作用的纳米簇及其制备方法和应用，通过分子设计手段，筛选获得一种具有杀菌作用的纳米簇。

本发明具有杀菌作用的纳米簇，其结构式如下：

其中x、y、z的数值区间分别为1-100，m为4或5，n为5或6。

本发明具有杀菌作用的纳米簇的制备方法，是以4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸为链转移剂，以偶氮二异丁腈(aibn)为引发剂，以聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为原料，首先合成了含有羟基的纳米簇；再以含有羟基的纳米簇、溴己酰氯和三乙胺为原料，合成得到含有溴基的纳米簇；随后以含有溴基的纳米簇和硫代乙酸钾原料，合成得到含有硫酯基的纳米簇，然后在哌啶和n,n'-二甲基甲酰胺的条件下切断，得到含有巯基的纳米簇，最后通过原位聚合得到目标产物。

本发明具有杀菌作用的纳米簇的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：纳米簇的合成

在氮气保护下，将链转移剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、引发剂偶氮二异丁腈(aibn)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(300)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(360)以及乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)加入史莱克管中，油泵抽气-液氮冷冻-氮气充气三个循环，每个循环做8-12次，循环结束后，升温至60-100℃，搅拌反应8-24小时，反应结束后在冰的正己烷中沉降，真空干燥后得到含有羟基的纳米簇；

其中，链转移剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、引发剂偶氮二异丁腈(aibn)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(300)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(360)以及乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)的摩尔比为0.1-10:0.01-1:1-100:1-100:0.1-1。

步骤2：酯化反应

将步骤1获得的含有羟基的纳米簇、溴己酰氯和三乙胺按照0.1-1:0.1-5:0.1-6的摩尔比加入配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中，常温反应8-24小时，合成含有溴基的纳米簇；

步骤3：取代反应

以步骤2获得的含有溴基的纳米簇和硫代乙酸钾按照0.1-2:0.2-5的摩尔比加入配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中，常温反应8-24小时，合成得到含有硫酯基的纳米簇；

步骤4：切断反应

将步骤3获得的含有硫酯基的纳米簇加入哌啶和n,n'-二甲基甲酰胺混合溶液中，常温反应3-10小时，得到含有巯基的纳米簇；

混合溶液中哌啶和n,n'-二甲基甲酰胺的体积比为0.1-10:0.2-20。

步骤5：原位聚合

将步骤4获得的含有巯基的纳米簇20-80mg溶于5-50ml去离子水中，加入1-30mg的nabh4，逐滴加入浓度为0.01-20mg/ml的agno3溶液1-100ml，即可得到目标产物。

一方面，可以得到尺寸小于200nm的水溶性聚合物，另一方面，聚合物中银纳米颗粒的引入，具有很好的杀菌性能。

步骤1中，纳米簇的合成过程如下：

所述有机溶剂选自四氢呋喃、n,n'-二甲基甲酰胺、氯仿或二氧六烷等。

步骤2中，羟基和溴己酰氯的酯化反应过程如下：

所述有机溶剂选自四氢呋喃、n,n'-二甲基甲酰胺、氯仿或二氧六烷等。

步骤3中，溴基和硫代乙酸钾的取代反应过程如下：

所述有机溶剂选自四氢呋喃、n,n'-二甲基甲酰胺、氯仿或二氧六烷等。

步骤4中，巯基的切断反应过程如下：

所述有机溶剂选自四氢呋喃、n,n'-二甲基甲酰胺、氯仿或二氧六烷等。

步骤5中，原位聚合合成银纳米的过程如下：

所述溶剂选自水。

本发明具有杀菌作用的纳米簇的应用，是配制成一定浓度的溶液直接喷涂于伤口表面，用于治疗和预防各种细菌的感染。

本发明具有杀菌作用的纳米簇具有良好的水溶性，所述溶液的浓度以所含银颗粒的浓度计为5-30μg/ml效果最好，一般6-8天小鼠伤口完全愈合。

本发明具有杀菌作用的纳米簇制备简单，所用材料环保，在生物医疗领域中具有很大的潜在应用价值。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明通过可逆加成-断裂链转移聚合(raft聚合)的方法设计制备得到纳米簇，该方法制备得到的纳米簇既分子量可控，又继承了聚乙二醇甲基丙烯酸酯的优良的水溶性性能。

2、本发明采用聚合反应，应用简单快速，后处理简便，反应条件可控，重复性好，容易实现工业化生产。

3、本发明采用原位合成纳米簇技术，有效降低了有机溶剂的使用，操作方法简单易行，所制得的纳米簇大小稳定均一，能够在水中稳定分布和存在。相比于单纯的银颗粒或者聚合物，本发明制备的纳米簇具有更低的的毒性，有望在细菌感染方面得到广泛的应用。

需要说明的是，在符合本领域常识的基础上，上述各条件可以任意组合即得本发明的较佳实施例。

附图说明

图1是纳米簇由硫酯基到巯基变化前后红外图谱，由图1可以看出，含巯基的纳米簇均在2500cm^-1处出现巯基特征吸收峰，而在含有硫酯基的纳米簇中没有出现，由此可见硫酯基纳米簇被切断，所得产物为含巯基纳米簇。

图2是得到的纳米簇在动态光散射(dls)中的粒径分布图。由图2可以看出，水溶性交联纳米聚合物的粒径分布较好，尺寸大小约为200nm。

图3是得到的水溶性纳米簇在透射电子显微镜(tem)下的透射电镜图，标尺为200nm，由图3可以看出，具有杀菌作用的纳米簇表面的银颗粒分布均匀，大小较为规整，尺寸大小约为15nm。

图4是普通的银颗粒杀菌效果图。

图5是本发明合成的纳米簇的杀菌效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步详细的说明本发明。应理解下面实施例仅说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1：

1、氮气保护下，将0.028g(0.0001mol)4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸，0.0016g(0.00001mol)偶氮二异丁腈(aibn)，2.7g(0.009mol)聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(oegma-300)，0.36g(0.001mol)聚乙二醇甲基丙烯酸酯(oegma-360)，0.007928g(0.00004mol)乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)加入史莱克管中，加入10mln,n'-二甲基甲酰胺作溶剂，抽气-冷冻-充气三个循环，每个循环做10次。循环结束后，升温至70℃，搅拌反应12h，在正己烷中沉降，然后真空干燥。得到了含有羟基的亲水性纳米簇，产率为98％；

2、以步骤1制备的含有羟基的亲水性纳米簇2.98g为原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入0.85g(0.004mol)溴己酰氯，0.606g(0.006mol)三乙胺(tea)，加入10mln,n'-二甲基甲酰胺作溶剂。反应12h后，过滤，在正己烷中沉降。沉降重复三次，然后真空干燥。得到了含有溴基的亲水性纳米簇，产率为90％；

3、以步骤2制备的含有溴基的亲水性纳米簇2.8g为原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入0.68g(0.002mol)硫代乙酸钾(ksac)，加入10mln,n'-二甲基甲酰胺作溶剂。反应12h后，过滤，在正己烷中沉降，得到了含有硫酯基的亲水性纳米簇，产率为95％；

4、以步骤3制备的含有硫酯基的亲水性纳米簇2.7g原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入摩尔比为3ml的哌啶和6mln,n'-二甲基甲酰胺为溶剂，反应12h后，过滤，在正己烷中沉降，得到了含有巯基的亲水性纳米簇，产率为86％；

5、以步骤4制备的含有巯基的亲水性纳米簇2.55g原料，在配有搅拌磁子的单口瓶中中加入50mg的硼氢化钠，逐滴加入10mg/ml的硝酸银(agno3)溶液，反应5h后，离心，重溶，得到具有杀菌作用的纳米簇。

实施例2：

1、氮气保护下，将0.014g(0.00005mol)4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸，0.0032g(0.00002mol)偶氮二异丁腈(aibn)，2.4g(0.008mol)聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(oegma-300)，0.72g(0.002mol)聚乙二醇甲基丙烯酸酯(oegma-360)，0.003964g(0.00002mol)乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)加入史莱克管中，加入20ml二氧六环做溶剂，抽气-冷冻-充气三个循环，每个循环做15次。循环结束后，升温至80℃，搅拌反应10h，在正己烷中沉降，然后真空干燥。得到了含有羟基的亲水性纳米簇，产率为90％；

2、以步骤1制备的含有羟基的亲水性纳米簇2.81g为原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入0.64g(0.003mol)溴己酰氯，0.505g(0.005mol)三乙胺(tea)，加入20ml二氧六环做溶剂。反应10h后，过滤，在正己烷中沉降。沉降重复三次，然后真空干燥。得到了含有溴基的亲水性纳米簇，产率为91％；

3、以步骤2制备的含有溴基的亲水性纳米簇2.5g为原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入0.34g(0.003mol)硫代乙酸钾(ksac)，加入20ml二氧六环做溶剂。反应10h后，过滤，在正己烷中沉降，得到了含有硫酯基的亲水性纳米簇，产率为87％；

4、以步骤3制备的含有硫酯基的亲水性纳米簇2.1g原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入摩尔比为5ml的哌啶和5mln,n'-二甲基甲酰胺为溶剂，反应10h后，过滤，在正己烷中沉降,得到了含有巯基的亲水性纳米簇,产率为89％；

5、以步骤4制备的含有巯基的亲水性纳米簇1.8g原料，在配有搅拌磁子的单口瓶中中加入10mg的硼氢化钠，逐滴加入1mg/ml的硝酸银(agno3)溶液，反应8h后，离心，重溶。得到具有杀菌作用的纳米簇。

实施例3：

1、氮气保护下，将0.028g(0.0001mol)4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸，0.0016g(0.00001mol)偶氮二异丁腈(aibn)，2.7g(0.009mol)聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(oegma-300)，0.36g(0.001mol)聚乙二醇甲基丙烯酸酯(oegma-360)，0.007928g(0.00004mol)乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)加入史莱克管中，加入15mln,n'-二甲基甲酰胺作溶剂，抽气-冷冻-充气三个循环，每个循环做10次。循环结束后，升温至70℃，搅拌反应16h，在正己烷中沉降，然后真空干燥。得到了含有羟基的亲水性纳米簇，产率为89％；

2、以步骤1制备的含有羟基的亲水性纳米簇2.65g为原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入0.64g(0.003mol)溴己酰氯，0.505g(0.005mol)三乙胺(tea)，加入15mln,n'-二甲基甲酰胺作溶剂。反应16h后，过滤，在正己烷中沉降。沉降重复三次，然后真空干燥。得到了含有溴基的亲水性纳米簇，产率为96％；

3、以步骤2制备的含有溴基的亲水性纳米簇2.41g为原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入0.3426g(0.003mol)硫代乙酸钾(ksac)，加入15mln,n'-二甲基甲酰胺作溶剂。反应16h后，过滤，在正己烷中沉降，得到了含有硫酯基的亲水性纳米簇，产率为88％。

4、以步骤3制备的含有硫酯基的亲水性纳米簇2.1g原料，在配有双排管、搅拌磁子的两口瓶中中加入摩尔比为3ml的哌啶和6mln,n'-二甲基甲酰胺为溶剂，反应16h后，过滤，在正己烷中沉降,得到了含有巯基的亲水性纳米簇,产率为88％；

5、以步骤4制备的含有巯基的亲水性纳米簇1.75g原料，在配有搅拌磁子的单口瓶中中加入50mg的硼氢化钠，逐滴加入1mg/ml的硝酸银(agno3)溶液，反应5h后，离心，重溶。得到具有杀菌作用的纳米簇。

实施例4：最小抑菌浓度(mic)的测定

将不同浓度的具有杀菌作用的纳米簇溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过细菌的生长与否，确定纳米簇抑制金黄色葡萄球菌生长的最低浓度，即mic。操作步骤如下：(1)含纳米簇培养基的配制：纳米簇用无菌水做对倍系列稀释成不同浓度的受液(231、115.5、57.7、28.8、14.4、7.2μg/ml)，取各稀释受液1ml加入到含有1ml菌液的液态培养基中，测出纳米簇的mic值，如果其值很小，再缓慢降低纳米银的浓度，尽可能使mic准确；(2)取100μl含菌量约为10⁸cfu/ml菌悬液接种于含纳米簇的营养肉汤培养基中，作为试验组样本；(3)取同样浓度的菌悬液接种到营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本；(4)取两支含有营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本；(5)将试验组样本、阳性对照组样本和阴性对照组样本放置于37℃培养箱，培养24h，观察结果；抑菌效果评定：当阳性对照管有细菌生长，阴性对照管没有细菌生长，实验用菌悬液的浓度为5×10⁵cfu/ml～5×10⁶cfu/ml，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抑菌浓度，为最小抑菌浓度mic；

实施例5：测定最小杀菌浓度(mbc)

取实验组，按上述方法培养24h后无菌生长的最高稀释度所对应的样品100μl，进行活菌培养计数，同时按同样方法测试不含纳米银聚合物的阳性对照组的活菌数。

式中，n0：培养24h后阳性对照组的菌落数；n：培养24h后实验组的菌落数。

以上所述仅为本发明的部分实施例，并不意味着本发明必须依赖上述工艺流程才能实施。对本发明的任何改进，对本发明各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

表1是普通银颗粒对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度；表2是本发明合成纳米簇针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度。通过和表2对比，可以看出本发明具有杀菌作用的纳米簇具有3-4倍于普通银颗粒的杀菌效果；

表1

表2