一组鉴别小管福寿螺的特异性引物对及方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种鉴别小管福寿螺的特异性引物对及方法和应用。

背景技术：

福寿螺隶属于软体动物们(mollusca)，腹足纲(gastropoda)，新进腹足目(caeogastropoda)，瓶螺科(ampullariidae)，福寿螺属(pomaceaperry,1810)。福寿螺自20世纪80年代初作为食物引种并定殖到我国，但由于其口味欠佳而被人们弃养，并在田间大量繁殖；目前该螺已迅速扩展到浙江、福建、广东、广西、海南、云南、贵州、江西、四川、重庆、湖南和安徽等省份并为害成灾。福寿螺个体大、食性广、适应性强、生长繁殖快、产量高，其中小管福寿螺(pomaceacanaliculatalamarck,1822)是我国首批列入的外来入侵物种。2010年我国首次报道有福寿螺属的另一个种斑点福寿螺p.maculata存在(潘颖瑛等，2010)，且被检出有广泛分布(lvetal.,2012)。以上两种福寿螺对我国的侵入造成危害了广泛的水稻种植区，同时对生态环境造成极大的影响。这两种福寿螺是我国广州管圆线虫的主要中间宿主，广州管圆线虫病是一种人兽共患病，感染者的症状为剧烈头痛、恶心、呕吐、发热、昏迷、精神失常等，严重者可造成死亡或有后遗症。浙江温州和福建长乐等地广州管圆线虫病暴发均由食用福寿螺引起。福寿螺成为我国传播广州管圆线虫的重要中间宿主，也引起广泛寄生虫学者们的重视。小管福寿螺与斑点福寿螺为同属的近缘物种，在栖息环境、形态特征等诸多方面具有高度的相似性，均具备高度的环境适应能力，以及强大的繁殖力。但二者对于杀螺药的敏感性、各种环境的适应性、感染广州管圆线虫的易感性均未见有恰当的评估。因此，快速鉴别自我国不同地区的两种福寿螺，为研究福寿螺的遗传和进化提供了依据，对于我国研究广州管圆线虫病的预防和控制有重要意义。

由于依据传统外观形态特征很难进行福寿螺种类的准确鉴定，虽然可通过其内部的解剖学特征来辨别两种福寿螺，但操作复杂，同时依赖鉴别人丰富的操作经验。分子鉴定具有快速准确及简便的优点，目前公布的分子鉴别手段，包括：(1)pcr扩增福寿螺细胞色素氧化酶c(cox1)测序比对已鉴定具体螺种(lvetal.,2012)；(2)多重pcr辅助鉴定具体螺种(201610022843.0)。但上述方法前者依赖于测序结果的比对，耗时较长。而且两种方法皆基于线粒体基因，但线粒体基因是母系遗传，子代的线粒体基因和母本一致，而小管福寿螺与其他福寿螺存在杂交种，当检测对象是杂交种时，前述两种方法会将杂交种判断为纯种，无法区分小管福寿螺和以小管福寿螺为母本的杂交种，所以上述两种方法并非是较佳的鉴别分子标记。因此，本领域急需开发一种能够快速、准确的鉴别小管福寿螺的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一组能有效鉴别小管福寿螺的特异性引物对及方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明提供一组鉴别小管福寿螺的特异性引物对，其核苷酸序列为：

pc-f：5’-atgatagcatcgcatcttct(如seqidno:1所示)，或其互补序列；

pc-r：5’-tcgttgttggcacttctaa(如seqidno:2所示)，或其互补序列。

本发明还提供基于pcr快速鉴别小管福寿螺的方法，包括如下步骤：

1)提取待测福寿螺样本的基因组dna；

2)以步骤1)提取的基因组dna为模板，用如seqidno:1所示和如seqidno:2所示的一对特异性引物进行pcr扩增；

3)对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，在凝胶成像仪下进行观察，查看目标位置是否出现特异性条带。

具体的，步骤2)中进行pcr扩增的pcr反应体系为：每个pcr反应的总体积为20μl，包含11.6μlh2o、2μl10×buffer(100mmtris-hcl(ph8.3)，500mmkcl，15mmmgcl2(takara))、2μldntp、0.4μltaq、特异性引物对的上、下游引物各1μl、目标样本的基因组dna2μl。

具体的，步骤2)中pcr扩增程序为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸60s；(5)步骤(2)—(4)重复35个循环后，72℃再延伸10min。

具体的，步骤3)中查看目标位置625bp是否出现特异性条带。

本发明还提供上述的特异性引物用于鉴别小管福寿螺的应用。采用本发明中的特异性引物可以达到快速、准确的鉴别小管福寿螺的目的。采用本发明中的特异性引物能够区分小管福寿螺与斑点福寿螺、中华圆田螺。采用本发明中的特异性引物能够区分小管福寿螺与小管福寿螺杂交种，比如小管福寿螺与斑点福寿螺的杂交种、或小管福寿螺与中华圆田螺的杂交种等。

本发明还提供上述的特异性引物在制备鉴别小管福寿螺的产品中的应用。

其中，所述产品包括检测试剂、检测试纸、检测试剂盒等生物检测领域常用的检测产品的形式。检测试剂盒包含上述特异性引物，该检测试剂盒可以采用上述扩增程序及检测方法进行检测。

本发明是通过生物信息学比较分析小管福寿螺三代测序组装的全基因组序列与斑点福寿螺的重测序组装序列，经过序列比对和筛选，最终针对小管福寿螺独有的组装序列group8_1339(全长4794bp)进行引物设计，获得所设计合成的特异性引物位于基因的3800-3819碱基与4406-4424碱基，产物片段为625bp。通过琼脂糖电泳查看目标位置是否出现特异性条带，判断检测对象是否是小管福寿螺。

本发明能够将小管福寿螺与外观形态极其相似的斑点福寿螺、中华圆田螺以及小管福寿螺杂交种区分开来，鉴别小管福寿螺的准确率高，阳性检出率为100％。斑点福寿螺、中华圆田螺以及小管福寿螺杂交种在目标位置625bp不会出现特异性条带。

本发明用于鉴别小管福寿螺只需要1次pcr结合电泳观察即可得到鉴别结果，检测过程快，耗时短。

本发明克服了现有方法的缺陷，能够用于区分小管福寿螺与小管福寿螺杂交种。

本发明通过分析小管福寿螺和斑点福寿螺的全基因组组装序列，经过序列比对和筛选，设计合成了一对分别位于小管福寿螺组装序列group8_1339(如seqidno:3所示)的3800-3819碱基与4406-4424碱基的特异性引物，用于快速、准确的小管福寿螺和斑点福寿螺。本发明的有益效果包括：1)检测过程快，耗时短；2)检测结果准确，分别率高，可靠性强；3)可以实现大量样品的高通量检测；4)方法操作简便易行，检测成本低。

附图说明

图1为实施例1的琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，1为小管福寿螺样本，2为斑点福寿螺样本，3为中华圆田螺样本，4为空白对照。

图2为实施例2的琼脂糖凝胶电泳的结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1特异性引物的属内特异性：

采用以下方法进行检测：

(1)提取目标样本的基因组dna；

采用dneasyblood&tissuekit(qiagen)按照说明书步骤进行dna抽提。

目标样本包括：1.小管福寿螺(p.canaliculata)样本；2.斑点福寿螺(p.maculata)样本；3.中华圆田螺(cipangopaludinacahayensis)样本。其中小管福寿螺样本为上海市青浦区采集，并经cox1及ef-1α测序比对验证。斑点福寿螺采集自美国佛罗里达州，同样经cox1及ef-1α测序比对验证。中华圆田螺采自上海市青浦区，经cox1测序比对验证。此外，实验中还同时检测4.空白对照(纯水h2o)。

(2)以步骤(1)中所提取的各目标样本基因组dna作为模板，用本发明所提供的引物seqidno:1和seqidno:2进行pcr扩增；

反应体系如下：每个pcr反应的总体积为20μl，包含11.6μlh2o、2μl10×buffer(100mmtris-hcl(ph8.3)，500mmkcl，15mmmgcl2(takara))、2μldntp、0.4μltaq、特异性上下游引物各1μl、目标样本的基因组dna2μl；

pcr扩增程序为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸20s；(5)步骤(2)—(4)重复35个循环后，72℃再延伸10min。

(3)对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，将跑好的琼脂糖凝胶放在凝胶成像仪下进行观察，查看目标位置是否出现特异性条带。

检测结果显示：样本1小管福寿螺在预期目标625bp处均能检出非常明显的特异性条带，阳性检出率为100％；样本2、样本3和空白对照无特异性条带；如图1所示4种样本的检测结果示意图。

实施例2检测不同地域的小管福寿螺样本的通用性和属内特异性：

采用以下方法进行检测：

(1)提取目标样本的基因组dna；

采用dneasyblood&tissuekit(qiagen)按照说明书步骤进行dna抽提。

目标样本包括：

小管福寿螺样本(p.canaliculata)：1.采集自上海市青浦区、2.采集自江西省南昌市、3.采集自湖南省长沙市、4.采集自浙江省杭州市、5.采集自贵州省贵阳市；6.采集自广西壮族自治区南宁市、7.采集自福建省福州市、8.广东省肇庆市、9.广东省深圳市、10.湖北省武汉市；

斑点福寿螺样本(p.maculata)：11.采集自美国佛罗里达州、12.采集自四川省成都市；

福寿螺杂交种样本(pomaceasp.)：13.采集自上海市青浦区、14.采集自四川省成都市、15.采集自四川省绵阳市；

中华圆田螺样本(cipangopaludinacahayensis)：16.采集自云南省大理市。

所有样本均经cox1测序比对验证，并且所有福寿螺样本均经ef-1α测序比对验证。此外，实验中还同时检测样本17.空白对照(模板为纯水)。

(2)以步骤(1)中所提取的各目标样本基因组dna作为模板，用本发明所提供的引物seqidno:1和seqidno:2进行pcr扩增；

反应体系如下：每个pcr反应的总体积为20μl，包含11.6μlh2o、2μl10×buffer(100mmtris-hcl(ph8.3)，500mmkcl，15mmmgcl2(takara))、2μldntp、0.4μltaq、特异性上下游引物各1μl、目标样本的基因组dna2μl；

pcr扩增程序为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸20s；(5)步骤(2)—(4)重复35个循环后，72℃再延伸10min。

(3)对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，将跑好的琼脂糖凝胶放在凝胶成像仪下进行观察，查看目标位置是否出现特异性条带。

如图2所示，检测结果显示：采自不同地域的小管福寿螺样本1-10在预期目标625bp处均能检出非常明显的特异性条带，阳性检出率为100％，通用性高；而斑点福寿螺样本11-12、福寿螺杂交种样本13-15、中华圆田螺样本16和空白对照样本17在预期目标625bp处无特异性条带，特异性强。如图2所示17种样本的检测结果示意图。实验结果说明，本发明的方法和引物用于不同地域的小管福寿螺的检测具有高度的通用性，用于小管福寿螺区分于斑点福寿螺、福寿螺杂交种及中华圆田螺具有高度的特异性。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>复旦大学

<120>一组鉴别小管福寿螺的特异性引物对及方法和应用

<130>cpc-np-18-101270

<160>3

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<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>1

atgatagcatcgcatcttct20

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>2

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<210>3

<211>4794

<212>dna

<213>group8_1339

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