针对H3K64Ac/H3K64片段的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术或生物医学领域，涉及针对组蛋白3第64位赖氨酸乙酰化修饰及未修饰(h3k64ac/h3k64)片段的纳米抗体及其应用。

背景技术：

抗体(ab)，也称为免疫球蛋白(ig)，是主要由免疫系统用于中和致病菌和病毒等病原体的浆细胞产生的大型y型蛋白质。抗体由适应性免疫系统的b细胞分泌，大部分由称为浆细胞的分化b细胞分泌，属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，它们构成血液蛋白质的大部分γ球蛋白部分。我们目前最常用的是igg型抗体，这类抗体在人体内也是含量最高的抗体，约9.5-12.5g/l。常规抗体通常由两条大的重链和两条小的轻链构成，重链与轻链之间通过二硫键结合形成对称的y型抗体。由于抗体可以高效地与体内和体外各种抗原特异性结合，使得抗体不仅应用于调节免疫系统方面，还能够用作医学治疗的生物工具和医学诊断方面的高灵敏的检测工具。目前，抗体药物的开发是生物技术药物研发的重要组成部分，抗体试剂的应用也是生物学实验中最常用的研究方法。因此，抗体相关产品的开发具有很大的应用前景和商业价值。

关于h3组蛋白第64位点赖氨酸的乙酰化修饰(h3k64ac)具有调控核小体的稳态和促进转录的功能的研究是近期的研究热点。这些研究选用了常规的抗h3k64ac抗体作为实验工具，但是常规抗体具有分子量较大、稳定性较弱、不易获得、制备成本高等缺点，且抗体分子过大不利于此类核小体核心区域位点体内实验的研究。这就引发了我们寻求分子量小，稳定性强，能对核小体核心区进行检测的新型抗体工具的兴趣，从而克服生物研究中遇到的困难。研究表明，骆驼的血液中存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为vhh抗体。vhh抗体的晶体直径仅有2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体(nanobody)。纳米抗体的大小约为12-15kda，只有传统igg型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段，且纳米抗体具有组织穿透力强、理化性质稳定、来源容易、产量高、可通过微生物进行扩大培养等优点。

技术实现要素：

为了克服现有技术中针对h3k64ac/h3k64的常规抗体的分子量较大、稳定性较弱、不易获得、制备成本高等技术缺陷，本发明的目的是提供针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体及其氨基酸序列，同时提供针对h3k64ac/h3k64片段纳米抗体的dna编码序列，构建该纳米抗体的真核质粒系统，用于替代传统抗体工具，以此研究该位点的生物学功能。

本发明筛选能够特异性识别h3k64ac的纳米抗体，验证其特异性和结合靶抗原的能力，再通过基因工程技术将纳米抗体基因序列构建入真核质粒载体系统pcdna5-frt(flag标签)中，用于替代传统单抗工具，以此来研究h3k64ac的生物学功能，也大大降低了研究成本。此外，我们也筛选到能够识别h3k64的纳米抗体，可以用于鉴定体内h3k64位点分布，同时可以作为h3k64位点乙酰化修饰验证的对照工具。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：针对h3k64ac片段的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的序列包括互补决定区cdr；所述互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列；

所述的纳米抗体的互补决定区cdr的序列包括下述(1)-(4)中的至少一种：

(1)seqidno:5所示cdr1，seqidno:6所示cdr2，seqidno:7所示cdr3；

(2)seqidno:12所示cdr1，seqidno:13所示cdr2，seqidno:14所示cdr3；

(3)seqidno:16所示cdr1，seqidno:17所示cdr2，seqidno:18所示cdr3；

(4)seqidno:20所示cdr1，seqidno:21所示cdr2，seqidno:22所示cdr3。

抗h3k64ac片段的纳米抗体为vhh链，具有seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36的至少一条所示的氨基酸序列。

所述的纳米抗体序列还包括框架区fr；所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列；框架区fr的氨基酸序列分别为：

seqidno:1所示fr1，seqidno:2所示fr2，seqidno:3所示fr3，seqidno:4所示fr4(对应于上述的互补决定区cdr的序列(1)；

或seqidno:8所示fr1，seqidno:9所示fr2，seqidno:10所示fr3，seqidno:11所示fr4(对应于上述的互补决定区cdr的序列(2)；

或seqidno:1所示fr1，seqidno:2所示fr2，seqidno:15所示fr3,，seqidno:4所示fr4(对应于上述的互补决定区cdr的序列(3)；

或seqidno:19所示fr1，seqidno:2所示fr2，seqidno:3所示fr3，seqidno:4所示fr4((对应于上述的互补决定区cdr的序列(4)；

上述所有fr1、fr2、fr3和fr4的序列可替换为其保守序列变体。

本发明还提供针对h3k64片段的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的序列包括互补决定区cdr；所述互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列；

所述的纳米抗体的互补决定区cdr的序列包括下述(1)-(2)中的至少一种；

(5)seqidno:24所示cdr1，seqidno:25所示cdr2，seqidno:26所示cdr3；

(6)seqidno:30所示cdr1，seqidno:31所示cdr2，seqidno:32所示cdr3。

抗h3k64片段的纳米抗体为vhh链，具有seqidno:37、seqidno:38的至少一条所示的氨基酸序列。

所述的纳米抗体序列还包括框架区fr；所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列；框架区fr的氨基酸序列分别为：

seqidno:8所示fr1，seqidno:9所示fr2，seqidno:24所示fr3，seqidno:4所示fr4(对应于上述的互补决定区cdr的序列(5)；

或seqidno:8所示fr1，seqidno:28所示fr2，seqidno:29所示fr3，seqidno:30所示fr4(对应于上述的互补决定区cdr的序列(6)；

上述所有fr1、fr2、fr3和fr4的序列可替换为其保守序列变体。

本发明还提供针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体，所述的纳米抗体的序列包括互补决定区cdr；所述互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列；

所述的纳米抗体的互补决定区cdr的序列包括下述(1)-(6)中的至少一种：

(1)seqidno:5所示cdr1，seqidno:6所示cdr2，seqidno:7所示cdr3；

(2)seqidno:12所示cdr1，seqidno:13所示cdr2，seqidno:14所示cdr3；

(3)seqidno:16所示cdr1，seqidno:17所示cdr2，seqidno:18所示cdr3；

(4)seqidno:20所示cdr1，seqidno:21所示cdr2，seqidno:22所示cdr3；

(5)seqidno:24所示cdr1，seqidno:25所示cdr2，seqidno:26所示cdr3；

(6)seqidno:30所示cdr1，seqidno:31所示cdr2，seqidno:32所示cdr3。

上述(1)-(6)的所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。

本发明还提供核苷酸序列，该核苷酸序列编码前述的纳米抗体，其核苷酸序列如seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41或seqidno:42所示；或者编码权利要求4-6任意一项所述的纳米抗体，其核苷酸序列如seqidno:43或seqidno:44所示；或者编码权利要求7所述的纳米抗体，其核苷酸序列如seqidno:39-44所示。

本发明的又一个目的是提供表达载体，其包含前述的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供宿主细胞或非人生物体，其可以表达出前述的纳米抗体，或其包含前述的表达载体。

本发明还提供上述的核苷酸序列在构建pcdna5/frt重组质粒中的应用，所述的重组质粒为能表达针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体的表达载体。

本发明还保护纳米抗体在h3k64ac/h3k64位点生物学功能研究、与目标抗原在原核水平识别、h3k64ac/h3k64区域抗原表位的分析鉴定或抗h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体的特异性分析中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明采用klh-h3k64ac(klh-cellirk(ac)lp)片段免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立针对h3k64ac片段的纳米抗体基因文库，将h3k64ac片段偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对h3k64ac特异性的纳米抗体基因，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，根据序列比对软件分析各个克隆株的基因序列，获得针对h3k64ac片段的纳米抗体vhh链的氨基酸序列，并证明该纳米抗体可以和h3k64ac片段特异性结合，同时也获得针对h3k64片段的纳米抗体vhh链的氨基酸序列，并构建pcdna5/frt真核重组质粒。本发明最显著的优点：1、本纳米抗体通过微生物可以高效表达，产量可达到100mg/l；2、本纳米抗体的分子量不到常规抗体的十分之一，从而能够实现对核小体核心区域h3k64乙酰化修饰位点生物学功能的实时研究。

附图说明

图1是h3k64ac-klh抗原免疫后血清效价检测图，免疫后血清效价达到10⁴以上，证明免疫成功；

图2是表达的针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体，经镍柱树脂亲和层析纯化后的sds-page电泳图，其中标记m是蛋白marker，泳道1-6分别为seqidno:33、seqidno:37、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:38所示的纳米抗体分子；

图3是筛选出的六株纳米抗体对抗原识别能力的酶联免疫吸附鉴定结果，结果表明seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35对h3k64ac的特异性识别能力较强，seqidno:36对h3k64ac的识别能力较弱，seqidno:37、seqidno:38能同时识别h3k64ac和h3k64；

图4是细胞水平上抗h3k64ac纳米抗体特异性识别h3k64ac位点并与h3抗体发生共定位的荧光鉴定结果，结果初步显示抗h3k64ac纳米抗体能特异性识别h3k64ac位点并与h3抗体发生共定位；

图5是获得的针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体序列构建入pcdna5-frt载体重组质粒的酶切鉴定示意图，其中标记m是蛋白marker，泳道1-2为酶切后的pcdna5/frt载体片段，泳道3-8为seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43、seqidno:44所示的酶切后片段；

图6是以抗h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体重组质粒在293fit细胞中表达的蛋白质免疫印迹示意图，泳道1-5为seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:43、seqidno:44所示构建的重组质粒的表达结果，泳道6为阴性对照，以α-微管蛋白(α-tublin)作为实验内参；

图7是纳米抗体制备的大致流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体

单域抗体(sdab，也被研发者ablynx称为纳米抗体或vhh)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(cdr)1(cdr1)、单个cdr2和单个cdr3。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。

单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的vhh分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有cdr1、cdr2和cdr3以及框架区。纳米抗体的分子量仅为约12-15kda，比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体的分子量(150-160kda)小得多。

在一些实施例中，针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体为复合物，其含有两种或两种以上的单链抗体，该复合物是二价抗体或多价抗体，二价或多价可以使抗体以高亲合力结合多聚体抗原。在一些实施例中，针对h3k64ac/h3k64片段区域的纳米抗体只含有(1)-(6)所述的单链抗体。

值得一提的是，本发明中，与本发明公开的cdr1-3的序列同源性高的序列，也可以得到h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体。在一些实施例中，与(1)-(6)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。

在一些实施例中，与(1)-(6)中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸的替换，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的cdr1、cdr2和cdr3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：asp、asn、glu、gln；(b)极性带正电残基：his、arg、lys；(c)芳香族残基：phe、trp、tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、gly、pro、met、leu、ile、val、cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：asp被glu取代；asn被gln或his取代；glu被asp取代；gln被asn取代；his被asn或gln取代；arg被lys取代；lys被arg、gln取代；phe被met、leu、tyr取代；trp被tyr取代；tyr被phe、trp取代；ala被gly或ser取代；ser被thr取代；thr被ser取代；gly被ala或pro取代；met被leu、tyr或ile取代；leu被ile或val取代；ile被leu或val取代；val被ile或leu取代；cys被ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在cdr1-3区，而框架区序列fr1-4并非是不可改变的，fr1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。

本发明采用klh-h3k64ac片段免疫新疆双峰驼，经过6次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立针对h3k64ac片段特异的纳米抗体文库。将h3k64ac片段偶联在酶标板上，展示正确的空间结构，使得h3k64ac片段的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选h3k64ac/h3k64片段免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，纳米抗体的整个筛选过程如图7所示。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对h3k64ac片段的纳米抗体文库的构建

(1)将200μgh3k64ac片段抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫6次，免疫过程中刺激b细胞表达特异性的纳米抗体，其中抗体效价在免疫6次结束后测定，结果为10⁴(图1)；(2)6次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总rna；(3)合成cdna并利用套式pcr扩增vhh；(4)利用限制性内切酶pstⅰ及notⅰ酶切20μgpmecs噬菌体展示载体及10μgvhh并连接两种片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞tg1中，构建h3k64ac片段纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为1.2×10⁸；于此同时，通过菌落pcr检测所建文库的插入率，结果显示插入率达到95％。

实施例2：针对h3k64ac片段的纳米抗体筛选过程

(1)取200μl重组tg1细胞至2×ty培养基中培养，期间加入40μl辅助噬菌体vcsm13侵染tg1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用peg/nacl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2)将500ng的h3k64ac片段偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照；(3)第二天加入100μl的3％bsa，室温封闭2h；(4)2h后，加入100μl扩增噬菌体(2×10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1h；(5)用pbs+0.05％tween-20洗掉结合的噬菌体；(6)用终浓度为25mg/ml的胰蛋白酶将与h3k64ac片段特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌tg1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步到富集。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(elisa)筛选特异性阳性克隆

(1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选300个单菌落分别接种于含100μg/ml氨苄青霉素的tb培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mm的iptg，28℃培养过夜；(2)利用渗透胀破法获得粗提抗体，并将抗体转移至经抗原包被的elisa板上，室温放置1h；(3)用pbst洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的鼠抗ha抗体(mouseanti-hatagantibody)，在室温放置1h；(4)用pbst洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体(anti-mousealkalinephosphataseconjugate)，在室温放置1h；(5)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405nm波长处，读取吸收值；(6)当样品孔od值大于对照孔3倍以上时，判定为阳性克隆孔；(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/ul氨苄青霉素的lb培养基中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件vectornti分析各个克隆株的基因序列，把cdr1，cdr2，cdr3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得4株h3k64ac片段特异性纳米抗体和2株识别h3k64片段纳米抗体。其抗体的氨基酸序列为seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38所示的fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4区，构成整个vhh。

实施例3：h3k64ac/h3k64片段纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化、表达及鉴定

(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒点转化到大肠杆菌wk6中，并将其涂布在lb+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5ml含有岸边青霉素的lb培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1ml的过夜培养菌种至330mltb培养液中，37℃摇床培养，培养到od600nm值达到0.6-0.9时，1:1000稀释加入1miptg，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，获得高纯度的纳米抗体，如图2所示，其中纳米抗体产量达到100mg/l；(6)将纳米抗体转移至经hdac6-wt和hdac6-cat1包被的elisa板上，室温放置1h；(7)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的鼠抗ha抗体(mouseanti-hatagantibody)，在室温放置1h；(8)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体(anti-mousealkalinephosphataseconjugate)，在室温放置1h；(9)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值，结果如图3所示，其中1、54、77号3株纳米抗体对h3k64ac识别能力较强，3、241号纳米抗体能对h3k64ac和h3k64具有较强识别能力，其中横坐标h3k64ac-1、h3k64-3、h3k64ac-54、h3k64ac-77、h3k64ac-85、h3k64-241分别对应seqidno:33、seqidno:37、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:38。由此可知，有的单一纳米抗体能同时识别h3k64ac、h3k64两种片段，例如seqidno:37、seqidno:38的纳米抗体同时对h3k64ac和h3k64具有较强识别能力。

实施例4：抗h3k64ac纳米抗体细胞水平特异性鉴定的应用

(1)对于细胞水平亲和力分析(图4)，本专利中采用针对h3抗体和h3k64ac纳米抗体对hela细胞同时孵育进行核的共定位，之后通过免疫荧光技术观察荧光是否重叠，分析纳米抗体是否识别细胞内部的h3k64ac；(2)hela细胞的培养：完全培养基为dmem+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(penicillin-streptomycinsolution)；(3)复苏hela细胞，选用dmem(10％fbs)培养基培养，待细胞密度长至70-80％时，将细胞分盘至12孔细胞培养板中，做细胞爬片，使其密度在30-40％左右；(4)待细胞贴壁后，吸尽上清，pbs洗一次，4％pfa室温固定15min；(5)pbs洗三次，5min/次，通透剂(pbs+0.2％tritonx-100)室温处理5min；(6)pbs洗一次，封闭液(pbs+2％bsa+0.3％tritonx-100)室温封闭1h；(7)pbs洗三次，5min/次，加绿色荧光标记的h3k64ac纳米抗体(1:300稀释)和抗h3抗体(兔源，1:3000稀释)，4℃过夜孵育；(8)pbs洗三次，5min/次，加荧光标记的二抗(anti-rabbit，1:2000稀释)，室温孵育1h；(9)pbs洗三次，5min/次，在载玻片上滴一滴dapi，将有细胞面的爬片覆盖在dapi上；(10)用中性树胶封片，用激光共聚焦显微镜拍片观察结果。

实施例5：建立抗h3k64ac/h3k64纳米抗体稳定表达细胞系的应用(图5、图6)

(1)为了分析h3k64ac位点的作用底物，以探究该位点的具体功能，本专利中构建抗h3k64ac/h3k64纳米抗体的重组真核质粒载体，利用flp-in^tm表达载体pcdna5/frt和flp重组酶载体pog44共转染flp-in^tm细胞系，高效构建稳定的哺乳动物表达细胞株，从而使细胞稳定整合和表达目的基因，进一步了解h3k64ac的生物学功能；(2)构建重组质粒pcdna5/frt-vhh，载体：pcdna5/frt，如图5所示；(3)转染293t细胞检测目的蛋白是否表达：293t细胞完全培养基为dmem+10％fbs；(4)第一天，铺细胞，12孔板，细胞密度35％-40％；(5)第二天，一般24h内，细胞密度达到70％-80％左右，进行转染；(6)重组质粒pcdna5/frt-vhh：脂质体＝1:3，质粒1μg，脂质体3μl，分别用无血清培养基稀释，室温静止5min，之后将质粒稀释液加入脂质体稀释液中，室温静置15min；(7)将混合液轻轻加入细胞培养基中，37℃细胞培养箱，培养36-48h，20h时换液一次；(8)细胞处理：将培养基移除，用pbs轻轻清洗一遍，之后用100μl细胞裂解液+蛋白酶抑制剂(ripa+pi)裂解细胞，冰上裂解15min，吸取细胞裂解液进1.5ml离心管中，12000rpm，10min，离心，将细胞裂解上清吸进新的离心管中；加5×lodingbuffer，用细胞裂解液稀释成1×，煮沸10min；跑sds-page蛋白胶；转膜，pvdf膜先用纯甲醇处理1min左右，恒流250ma，转膜1h；(9)5％milk室温封闭1h；(10)孵育一抗：0.5‰pbst清洗，一抗mouse-anti-hamab(1:5000)，稀释液3％bsa+0.1％nan3，4℃孵育过夜；(11)孵育二抗：0.5‰pbst清洗，二抗anti-mousehrp(1:20000)，pbs稀释，室温缓慢孵育1h；(12)曝光：0.5‰pbst清洗，曝光液a液与b液，1：1混匀，膜放至曝光盒正面朝上，用纸吸净膜上的液体，将配好的曝光液，均匀地敷在膜上曝光室用x光片曝光目的条带，检测纳米抗体是否表达；(13)转染293t-frt细胞(flp-in细胞系)：一个10cm细胞培养皿：重组质粒5μg+pog44质粒15μg+转染试剂(lipo2000)10μl；(14)加抗生素药潮霉素(hygromycinb)筛选阳性单克隆，生成稳定表达细胞系；(15)加盐酸强力霉素(doxycyclinehyclate)诱导剂诱导目的蛋白表达；(16)蛋白质免疫印迹鉴定蛋白表达；(17)得到稳定表达细胞系，进行功能上的分析实验。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

序列表

<110>南京融捷康生物科技有限公司

<120>针对h3k64ac/h3k64片段的纳米抗体及其应用

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