一种非酒精性脂肪肝细胞模型的建立方法与流程

本发明涉及人类非酒精性脂肪肝病模型制备领域，更具体地，涉及一种非酒精性脂肪肝细胞模型的建立方法。

背景技术：

非酒精性脂肪肝(non-alcoholfattyliverdisease,nafld)是一种慢性肝病，影响世界各地的成人和儿童人群健康，nafld可由以单纯脂肪堆积为特征的良性组织学疾病阶段(通常称为单纯性脂肪变性或非酒精性脂肪肝)发展为更为严重的组织学形式，以肝细胞损伤、混合炎性小叶浸润和非酒精性脂肪性肝炎(nash)为特征。疾病谱包括单纯性脂肪肝(nafl)、脂肪性肝炎(nash)及相关肝纤维化、肝硬化。不同程度的nafld由肝脏损伤程度划分，对人体健康影响程度不同。不同种族，性别，年龄的人群nafld发病条件，机制并不完全一致，因此，对于nafld的研究不应局限于一种细胞系。为了更好地探究脂肪肝的形成机制，有必要构建并优化出更多具有细胞源多样性的细胞模型。

如文献《非酒精性脂肪肝实验模型研究概况》公开了目前用于建立非酒精性脂肪肝细胞模型的造模药物多为油酸或油酸与亚油酸混合物，其中油酸是引起肝细胞三酰甘油积累的最主要脂肪酸，常用的造模细胞株为原代肝细胞、肝细胞株l-02和肝肿瘤细胞株hepg2。可见现有技术的缺陷和不足：科研中大多数脂肪肝细胞模型的建立都局限于个别几种细胞系，如hepg2，缺乏细胞来源的多样性。另外，大多数脂肪肝模型的建立时培养基均采用dmem培养基，尽管可较好的模拟体内环境建立脂肪肝模型，由于nafld细胞模型建立是模拟肝脏脂肪酸过度的微环境，即营养过剩状态。因此，培养基仍有优化空间。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种非酒精性脂肪肝细胞模型的建立方法，本方法方便快捷、效果显著、适用于多种细胞。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案具体包括：

(1)溶液配制；

(2)脂肪酸处理细胞；

(3)细胞油红染色验证细胞脂肪变性。

其中，步骤(1)溶液配制具体为：

1)油酸和棕榈酸在使用前75℃水浴10min；

2)配制20％和40％脱脂bsa溶液；

3)将完全溶解的油酸和棕榈酸溶液从75℃水浴中取出，迅速分别与步骤2)中配制好的20％bsa和40％bsa溶液混合，即得10mm油酸-bsa贮存液和20mm棕榈酸-bsa贮存液，再用0.22μm滤器过滤除菌；

4)高脂完全培养基的配制；

a.分别配制dmem培养基、dmem高糖培养基及f12培养基，并按照5％～30％的比例配制f12-dmem混合培养基，并分别添加终浓度为10％的fbs；

b.根据所需具体油酸和棕榈酸浓度，分别使用dmem培养基、dmem高糖培养基和不同比例f12-dmem混合培养基溶解油酸和棕榈酸；

其中，棕榈酸和油酸的比例优选为1:2，用dmem培养基稀释成1mm的终浓度处理细胞；

其中，步骤(2)脂肪酸处理细胞具体为：

1)细胞按1.5×10^⁴-1.5×10^⁵/well的数量接种到6孔板中，同时设立空白对照组，37℃，5％co2，培养12-18小时；

2)更换培养基，pbs清洗2次，分别加入含有1mm脂肪酸的10％fbs的dmem培养基，dmem高糖培养基，混合有5％～30％f12的dmem高糖培养基2ml,37℃，5％co2，培养24小时；

3)期间使用倒置显微镜观察细胞的生长状态；

其中，dmem高糖培养基中f12的浓度优选为20％；

其中步骤(3)细胞油红染色验证细胞脂肪变性，具体为：

1)相关溶液配制

配制油红o储备液：将油红o干粉溶解于100％异丙醇中，制成质量比为1：200的油红o溶液，充分溶解后过滤，4℃避光保存；

配制油红o工作液：实验前将储备液与蒸馏水按3:2稀释后过滤，现配现用；

配制60％异丙醇的配方：用蒸馏水稀释100％异丙醇，4℃保存；

2)染色步骤

a.将细胞培养皿从培养箱中取出，去除培养基，用4％甲醛清洗细胞并固定10min～15min；

b.60％异丙醇浸洗2min～5min；

c.取适量过滤好的油红o染液于培养皿中染色3min～5min；

d.60％异丙醇调色，pbs清洗2次；

e.苏木精复染10s～1min；

f.流水反蓝；

3)结果观察：倒置显微镜下观察细胞中的脂滴并对其计数；

其中，苏木精复染时间优选为20s。

本发明的另一个目的是提供一种根据建立的非酒精性脂肪性肝细胞模型在肝病研究中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明方便快捷，能在较短的时间内建立nafld细胞模型，效果好，具有良好的可重复性。

(2)本方法对多种肝脏细胞系nafld模型的建立有效，可实现nafld细胞模型的多样化，便于进行nafld发病机制，药敏学实验等医学研究。

(3)本发明改良了既往模型建立所用培养基，使用营养成分更多，更全面的培养基配比，并选用高糖培养基，使模型创建的培养基成分更全面并与脂肪酸共同形成营养过剩微环境，使细胞模型脂肪变性程度更高。

本发明对于建立nafld细胞模型具有较高的参考价值，适于推广应用。

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

附图说明

图1为实施例2中待脂肪酸处理细胞生长图。

图2为实施例3中不同培养基混合油酸处理huh-7细胞24小时油酸染色结果。

具体实施方式

实施例1溶液配制

1、油酸和棕榈酸在使用前75℃水浴10min，因其常温时水溶性差，配制时需以75℃水浴助溶；

2、配制20％和40％脱脂bsa溶液，称取脱脂bsa粉末并置入50ml离心管中，向离心管中小心加入2mlpbs溶液，切勿震荡或混匀，将离心管室温8000rpm离心15min，bsa即可完全溶解，离心结束后得黄色澄清bsa溶液，以pbs定容至上述浓度备用；

3、将完全溶解的油酸或棕榈酸溶液从75℃水浴中取出后，迅速分别与配制好的20％bsa和40％bsa溶液混合，即得油酸-bsa贮存液(10mm)和棕榈酸-bsa贮存液(20mm)，混合后溶液性状稳定，不再有固体析出，以0.22μm滤器过滤除菌后，可立即使用或保存于4℃冰箱备用；

4、高脂完全培养基的配制：首先配制细胞培养基，2：8的比例混合f12与dmem高糖培养基，并添加终浓度为10％的fbs制成非酒精性脂肪肝细胞模型培养液，根据所需具体油酸或棕榈酸浓度，以上述混合培养基溶解油酸或棕榈酸，为了构建脂肪变性模型，棕榈酸和油酸按照1:2的比列，以10％的dmem稀释成1mm的终浓度处理细胞。

实施例2脂肪酸处理细胞

1、细胞按1.5x10^5/well的数量接种到6孔板中，同时设立空白对照组，37℃，5％co2，培养15时；

2、更换培养基，pbs清洗2次，加入含有1mm脂肪酸的非酒精性脂肪肝细胞模型培养液2ml,37℃，5％co2，培养24小时；

3、期间使用倒置显微镜观察细胞的生长状态，结果如图1所示。

实施例3细胞油红染色验证细胞脂肪变性

1、相关溶液配制

油红o储备液的配方：将0.5g油红o干粉加入100ml100％异丙醇中，充分溶解，过滤，4℃避光保存；

油红o工作液的配方：实验前，将储备液与蒸馏水按3:2稀释，过滤(滤纸或极性滤膜配1ml注射器)，酒红色且无沉淀，现配现用原则，避免工作液出现沉淀；

60％异丙醇的配方：将60ml100％异丙醇和40ml蒸馏水混合均匀，4℃保存。

2、染色步骤

(1)将细胞培养皿从培养箱中取出，去除培养基，用4％甲醛清洗细胞并固定10min；

(2)60％异丙醇浸洗2min(提前润洗一下，便于油红o着色)；

(3)取适量过滤好的油红o染液于培养皿中染色5min；

(4)60％异丙醇调色，pbs清洗2次；

(5)苏木精复染20s；

(6)流水反蓝。

3、结果观察：倒置显微镜下观察细胞中的脂滴并对其计数。

本实施例均能看见细胞内有明显脂肪小滴的形成，建模成功。

由图2所见，三种培养基中，三种培养基中，两种培养基效果较好(dmem高糖培养基和2:8f12-dmem高糖培养基)，主要表现为细胞油酸染色效果更佳，即建模效果更好；且f12-dmem高糖2：8混合培养基平均细胞油滴数高于dmem高糖培养基，因此f12-dmem高糖2：8混合培养基为最佳非酒精性脂肪肝细胞模型造模培养基。