本发明涉及菌种培养领域，尤其是涉及一种调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的培养液及调节方法。
背景技术：
：：肠道菌群是人类与细菌共同经历了一个漫长的进化过程后形成的，是人类的“老朋友”。这种共同进化，导致宿主与肠道各种菌群之间存在着复杂的共生关系。益生菌(probiotics)是一种通过定于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主肠道微生物平衡而发挥作用的活性微生物的总称。益生菌被普遍认为具有广泛的保健功效，已经被应用在食品以及医药保健等领域，如活性益生菌乳饮料、酸奶等。近年来，许多研究已经证实益生菌对于儿童及成人腹泻、炎症性肠病、慢性肠炎、肝胆疾病、泌尿生殖系统疾病、过敏性疾病等都具有确切的治疗效果。乳杆菌是目前应用最多的乳酸细菌，是肠道主要的原籍菌群之一，是作为益生菌的主要菌种之一。嗜酸乳杆菌是在乳酸菌家族中极被重视与研究开发的益生菌之一，被视为第三代酸乳发酵剂菌种，是胃和人体小肠内的主要益生菌。该菌具有释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，抑制肠道不良微生物增殖，调节肠道菌群平衡，以及营养、抗癌、增强机体免疫力与抗衰老等作用。然而，目前对乳杆菌的培养只是一个粗放阶段，并没有精细的培养技术，尤其是涉及到能够调节乳杆菌内有益与有害元素含量的培养液及调节方法。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种调节乳杆菌(以嗜酸乳杆菌为例)生长速度及菌内元素含量的培养液及调节方法，解决目前在乳杆菌培养方面的技术空白。本发明的发明目的通过以下技术方案来实现：调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的培养液，该培养液是在传统培养液的基础上同时或者分别加入锌和硒元素，锌元素在该培养液中的浓度范围为0～1000ng/ml，硒元素在该培养液中的浓度范围为0～72ng/ml。优选的，硒元素在该培养液中的浓度为0～48ng/ml。优选的，硒元素在该培养液中的浓度为48ng/ml。调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的培养液，该培养液是在传统培养液的基础上加入锌元素和硒元素，锌元素在该培养液中的浓度范围为0～1000ng/ml，硒元素在该培养液中的浓度范围为0～72ng/ml。优选的，锌元素在该培养液中的浓度范围为0～600ng/ml，硒元素在该培养液中的浓度为0～36ng/ml。优选的，锌元素在该培养液中的浓度范围为600ng/ml，硒元素在该培养液中的浓度为36ng/ml。调节乳杆生长速度及菌内有益与有害元素含量的方法，利用前述第一种方案的培养液或第四种方案的培养液培养乳杆菌4小时，此时硒元素对嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度最大(在具体生产实践中，可根据乳杆菌生长速度、最终产量、有益与有害元素限量标准等多种因素综合平衡后确定培养时间)。调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的调节方法，利用前述第一种方案的培养液或第四种方案的培养液培养乳杆菌4～10小时，此时有益元素含量较高，有害元素含量较低。调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的调节方法，利用前述第一种方案的培养液或第四种方案的培养液培养乳杆菌6小时，此时有益元素含量与有害元素含量相对为优。与现有技术相比，本发明通过改变乳杆菌(以嗜酸乳杆菌为例)培养液配方，可以获得以下技术效果：1、提升嗜酸乳杆菌生长速度，目前最佳条件下可平均提速62.7％。2、上调菌体内有益元素含量，平均上调率分别为：锌(229.9％)、铜(63.8％)、锰(178.3％)、铁(581.7％)、钴(17.3％)、硒(423.1％)；同时，还可下调菌体内无益或有害元素含量，平均下调率分别为：铅(-148.2％)、钛(-101.4％)、银(-411.0％)、铀(-591.3％)。3、选择适当的培养时间和培养液配方还可进一步提升有益元素和降低有害元素的含量。4、借助生物转化技术提升菌体内有益元素含量所生产的乳杆菌将有助于提高人体免疫力、抗氧化、抗衰老、选择性排毒。附图说明图1为部分硒元素浓度组嗜酸乳杆菌生长曲线；图2为全部硒元素浓度组嗜酸乳杆菌生长曲线；图3为部分锌干预组嗜酸乳杆菌生长曲线；图4为全部锌干预组嗜酸乳杆菌生长曲线；图5为2h硒元素组与锌干预组od值对比；图6为4h硒元素组与锌干预组od值对比；图7为6h硒元素组与锌干预组od值对比；图8为8h硒元素组与锌干预组od值对比；图9为10h硒元素组与锌干预组od值对比。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例本发明提供调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的培养液，该培养液是在传统培养液(蛋白粉10.0g；牛肉粉10.0g；酵母提取物5.0g；柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g；葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g；吐温801.0ml；乙酸钠(ch3coona·3h2o)5.0g；磷酸氢二钾(k2hpo4·3h2o)2.0g；硫酸镁(mgso4·7h2o)0.58g；硫酸锰(mnso4·h2o)0.25g；琼脂18.0g；蒸馏水1000m；；ph6.2～6.6)的基础上加入硒元素，当硒元素在该培养液中的浓度为0～72ng/ml，能起到一定的提升嗜酸乳杆菌生长速度的效果。当硒元素在该培养液中的浓度为0～48ng/ml，提升效果较为明显。当硒元素在该培养液中的浓度为48ng/ml，提升效果最好。本发明还提供调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的培养液，该培养液是在传统培养液的基础上加入硒元素和锌元素，当硒元素在该培养液中的浓度为0～60ng/ml，锌元素在该培养液中的浓度为600ng/ml时，能起到提升嗜酸乳杆菌生长速度的效果，且在锌元素干预后，嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度和有益与有害元素调节效应均进一步增强。当硒元素在该培养液中的浓度为0～36ng/ml，提升嗜酸乳杆菌生长速度的效果较好。当硒元素在该培养液中的浓度为36ng/ml，提升嗜酸乳杆菌生长速度的效果最好。本发明还提供调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的调节方法，利用前述两种方案的培养液培养乳杆菌4小时，此时硒元素对嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度最大。本发明还提供调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的调节方法，利用前述两种方案的培养液培养乳杆菌4～10小时，此时有益元素含量较高，有害元素含量较低。本发明还提供调节乳杆菌生长速度及菌内元素含量的调节方法，利用前述两种方案的培养液培养乳杆菌6小时，此时有益元素含量与有害元素含量均为最优。为了证明前述各方案的效果，申请人进行了实验，并提供整个实验过程以及实验数据如下：1实验1.1实验材料与仪器1.1.1主要设备与耗材本实验所用的主要仪器与耗材如表1和表2所示。表1实验所用仪器table1instrumentusedintheexperiment表2实验所用耗材table2consumablesusedintheexperiment1.1.2主要试剂(1)单元素标准溶液zn、se、b、al、ti、ge、as、sr、li、co、ni、mo、ag、cd、sn、sb、ba、cs、u、cu、mn、rb、hg、pb、cr、fe、la、ce、pr、nd、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb、lu、y、bi、th，浓度：1000ng/ml，均购于国家有色金属及电子材料分析测试中心(2)内标溶液rh(1000ng/ml)、in(1000ng/ml)、re(1000ng/ml)，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心(3)标准物质猪肝(gbw10051)购自国家标准物质中心；plasmacontrol：8883、serumcontrol：8881、wholebloodcontrol：8841、clinchekcontrol，购自德国recipe公司；人发成分分析标准物质(gbw09101a)：中国科学院上海应用物理研究所；人发成分分析标准物质(gbw09101b)：中国科学院上海应用物理研究所；生物成分分析标准物质-猪肝：gbw10051(gsb-30)(4)细菌菌种嗜酸乳杆菌：cgmcc编号1.1878，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心1.2实验方法1.2.1实验设计与分组实验包括1个对照组及6个实验组，每组6个平行样。自行制备浓度约为1μg/ml的se溶液，并利用icp-ms定量，实验组与对照组先后加入相同体积的培养液和不同体积的se溶液，最后用超纯水定容至40ml，培养液中se浓度分别为0、12、24、36、48、60、72、96、192ng/ml，另外设置一组上述se浓度的含600ng/lzn的培养液，全部配制完成后高温灭菌备用。1.2.2嗜酸乳杆菌培养及其吸光度值测定根据实验要求活化扩增嗜酸乳杆菌菌种，待活化菌液较为浑浊后，于600nm多次测量其吸光度(od值)。待od值稳定在1±0.05时，取等量(100μl)活化菌液接种于不同zn浓度的mrs培养基，置于37℃恒温摇床(100r/min)培养。每2h将各管培养液摇匀，定量吸取2ml培养液于离心管中，再次摇匀后，取0.6ml用分光光度仪测定od值，测定时使用的空白液与待测液的se浓度保持一致；剩余1.4ml经离心后弃去上清液；在沉淀中加入1.4mlpbs溶液轻摇洗涤，经离心后弃上清液，再度重复上述步骤后，于沉淀物中加入100μl浓硝酸，室温下消化12h；消化液于-4℃冰箱保存，待测。1.2.3仪器条件优化及元素测定本次研究中，采用嗜酸乳杆菌菌液的吸光度值(od)代表其相对计数值。细菌接种前，先对分光光度仪仪器参数进行优化，优化结果如表3所示，离心机仪器参数如表4所示。元素测定前，先对icp-ms仪器参数进行优化，然后在最佳化仪器条件下进样测定。icp-ms测定的元素包括zn、se、b、al、ti、ge、as、sr、li、co、ni、mo、ag、cd、sn、sb、ba、cs、u、cu、rb、hg、pb、cr、fe、mn、la、ce、pr、nd、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb、lu等，其中cr、mn、fe由于受到质谱干扰，开启动态反应池(drc)模式进行测定，icp-ms测定上述元素的仪器参数如表5所示。用标准物质进行质控，确保样品前处理及检测过程的可靠性与准确性；在测量时加入内标，以校正仪器的信号漂移。对于元素含量超出标准曲线上限的样品，稀释一定倍数后重新上机测定。将冷消化后的细菌样品从冰箱取出后，室温下解冻，在每个icp-ms待测样品(0.1ml)中准确加入0.1ml混合内标(rh：20ng/ml、in：2ng/ml、re：2ng/ml)和1.8ml超纯水，充分混匀后离心，单次测定上清液中无机元素浓度。表3分光光度计仪器参数table3spectrophotometerinstrumentparameters表4离心机仪器参数table4centrifugeinstrumentparameters表5icp-ms仪器参数table5instrumentparametersoficp-ms1.2.4数据分析采用重复测量资料分析方法比较各组间od值及元素含量的差异，元素含量与od值之间的相关性采用spearman分析；各元素含量间的相关性采用偏相关分析。在结果表达中列出其相关系数，数值是正数时为正相关、是负数时为负相关，相关系数的绝对值越接近1，其相关性越好。以上统计方法，均设定双侧p<0.05时为差异具有统计学意义。2结果与讨论2.1嗜酸乳杆菌生长曲线实验中，通过分光光度仪每2小时测定一次嗜酸乳杆菌菌液的od值，获得嗜酸乳杆菌的生长曲线。如图1、图2所示，在硒元素组中，当培养液中硒浓度低于48ng/ml时，随着硒浓度的上升，对嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度逐渐增强，并在硒浓度为48ng/ml时达到实验中的最大刺激反应幅度；随后随着培养液中硒浓度继续增加，其对嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度逐渐减弱，当硒浓度上升到96ng/ml时，对嗜酸乳杆菌的生长已出现明显的抑制效应。在培养液中添加硒元素的基础上，对应施加600ng/ml的锌元素进行干预。锌素干预组嗜酸乳杆菌的生长曲线如图3、图4所示。由图可见，相比于单独添加硒元素，锌元素干预后，嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度和抑制效应均出现增强，同时，对其生长的最大刺激反应浓度由硒元素组中的48ng/ml变成了36ng/ml。为了更加直观的对比锌元素干预组和硒元素组的od值，取各个时间点单独进行观察，如图5～图9所示。3刺激反应幅度通过比较最大刺激浓度组与对照组在各个时间点的od值，我们获得了本实验中硒元素对嗜酸乳杆菌生长的最大刺激反应幅度，具体结果如表6所示。计算公式为(odmax-od对照)/od对照。结果显示：(1)最大刺激反应幅度出现在4小时培养时间；(2)锌干预组(zn+se)刺激幅度大于硒组。表6实验中元素添加对嗜酸乳杆菌的刺激反应幅度4各硒浓度组od值与嗜酸乳杆菌中各元素含量的组间效应分析此结果采用重复测量资料的组间效应分析，得到关于各组间od值的统计结果，p<0.001，差异有统计学意义，同时，根据功效分析给出的偏eta方结果显示，锌与硒同时添加对模型的贡献达到了97.6％，具体结果如表7所示。结果显示，在锌、硒同时存在条件下，硒的贡献率高于锌。表7实验各分组间吸光度值组间效应分析将每个嗜酸乳杆菌样品中元素含量值分别除以其对应od值，获得单位od值对应的各元素含量值。再对其采用重复测量资料的组间效应分析(方差分析)，得到30种元素的统计结果，如表8所示。结果显示，硒元素添加浓度作为实验因素时，所有元素的含量在各组间均有统计学差异(p<0.05)；而当锌元素作为实验因素时，除b、al、cd、ba外，其余元素的含量在各组间的差异均有统计学意义(p<0.05)；锌与硒共同作为实验因素时，除b、al、sb、sm、ba外，其他元素的统计结果均有统计学差异(p<0.05)。表8各分组间元素含量的组间效应分析5嗜酸乳杆菌中元素含量与od值相关性分析如表9和表10所示，硒元素组结果显示，19个元素与od值的相关系数有统计学意义zn(r＝0.921)、mn(r＝0.717)、se(r＝0.886)、sr(r＝0.63)与od值有较好的相关性，其余15种元素的相关系数介于0.3到0.6之间。锌元素干预组的结果显示，共有17种元素的相关系数具有统计学意义，se(r＝0.917)、zn(r＝0.981)、cu(r＝0.707)、co(r＝0.765)、sb(r＝-0.644)、fe(r＝0.682)、mn(r＝0.707)与od值有较好的相关性，其余10种元素的额相关系数介于0.3到0.6之间。由表9可见，在硒的作用下，与od值呈现正相关且相关系数高于0.5的元素有：zn(0.921)、mn(0.717)、se(0.886)、fe(0.599)、cu(0.571)，分别为中等或强的正相关，均为有益元素；而相关系数低于或者接近-0.5分别为pb(-0.481)、ti(-0.562)、ag(-0.563)、u(-0.582)，均非有益元素，甚至是有害元素。因此，在培养液中加入硒元素后，不仅仅可以提升菌量(产率)，还可以上调有益元素菌体内相对含量，下调有害元素菌体内相对含量。由表10可见，在锌、硒共同作用下，与od值呈正相关且相关系数大于0.6的元素包括锌、铜、锰、铁、钴、硒，上调有益元素的效果更加明显；而相关系数低于-0.5分别为钛、锶、铋；对于铅的下调作用有所降低(-0.382)，但仍然存在弱负相关。总而言之，有利于提高益生菌的品质。在最大刺激反应幅度时，对照组与实验组之间锌、铜、锰、铁、钴、硒等元素含量上调的百分率，以及pb(-0.481)、ti(-0.562)、ag(-0.563)、u(-0.582)等元素含量下调的百分如表11所示。表9硒48ng/ml之前各元素含量与od值相关系数表10锌干预组硒为36ng/ml之前各元素含量与od值相关系数锌、铜、锰、铁、钴、硒等元素含量改变的百分率，以及pb(-0.481)、ti(-0.562)、ag(-0.563)、u(-0.582)等元素含量下调的百分如表11所示。表11(a)“硒组”中元素含量改变的百分率(％)注：“-”表示与对照组相比元素含量降低；以se0+zn0为对照组表11(b)“硒+锌组”中元素含量改变的百分率(％)注：“-”表示与对照组相比元素含量降低；以se0+zn600为对照组表11(c)“硒+锌组”中元素含量改变的百分率(％)注：“-”表示与对照组相比元素含量降低；以se0+zn0为对照组用有刺激作用最大值后半部分做相关(se为48ng/ml之后，se+zn为36ng/ml之后)，结果如表12和表13所示。由表12可见，当培养液中硒元素进一步加大后，锌、铜、锰、铁、钴硒等有益元素含量与od值呈现强负相关，菌体内有益元素含量相对降低；而铅、钛呈现中等正相关，有害元素相对含量上升。锌干预组结果相似。表12硒元素为48ng/ml之后，各元素含量与od值相关系数表13锌干预组硒为36ng/ml之后各元素含量与od值相关系数6嗜酸乳杆菌中硒元素与各元素含量相关性分析通过偏相关分析，获得嗜酸乳杆菌中各元素含量值与硒元素含量值之间的相关性分析结果，如表14和表15所示，硒元素组结果显示，11种元素与硒元素之间存在相关性，其中cu(r＝0.709)、mn(r＝0.718)、zn(r＝0.823)与硒元元素含量具有较好的相关性，其余9种元素的相关性介于0.3到0.6之间。锌元素干预组的结果显示，共12种元素与硒元素之间存在相关性，其中cu(r＝-0.708)(铜与锌之间存在拮抗作用)、rb(r＝0.611)、la(r＝0.714)、zn(r＝0.811)与硒元素含量之间具有较好的相关性，其它8种元素的相关系数介于0.3到0.6之间。表14硒元素组各元素含量与硒元素相关系数表15锌元素干预组各元素含量与硒元素相关系数7元素含量随时间变化选取硒元素的最佳刺激浓度(硒元素组为48ng/ml，锌干预组为36ng/ml)的嗜酸乳杆菌，分别测其2h，4h，6h，8h，10h时的菌体内元素含量，分析单位od值元素含量的变化。如表16和表17所示。培养液硒调控时，单位od值最大元素浓度【emax】vs培养时间t：有益元素zn、se最佳培养时间为6小时，有害元素al、cd、u为10小时；因此，可以通过控制培养时间来提升有益元素含量，降低有害元素含量。锌干预组，有益元素锌、铜、锰、铁的最大值在6h；铅最大值也在6h，但实际上各个时间点变化不大；铝、铬、银、镉、铀最大值在10h；故同样可以选择培养时间，提升有益元素含量，降低有害元素含量。表16硒浓度组在硒元素浓度为48ng/ml时各时间点元素含量(平均值)表17锌干预组在硒浓度为36ng/ml时各时间点元素含量(平均值)8结论本研究以生命元素组学理论为基础，采用icp-ms等仪器与检测技术为实验手段，通过在培养液中添加不同浓度的se培养嗜酸乳杆菌，随即观测嗜酸乳杆菌的生长速度变化和嗜酸乳杆菌对培养液中无机元素的吸收利用情况。主要结论如下：(1)培养液中se的浓度变化会对嗜酸乳杆菌的生长产生刺激效应，并在se浓度为48ng/ml时达到最大刺激效果，当有zn的干预时，se的最佳刺激效应浓度为36ng/ml。(2)培养液中添加se还可以调节嗜酸乳杆菌菌体内其他元素的吸收，使得提升嗜酸乳杆菌益元素含量成为可能。以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，上述调节方法可用于多种发酵产品。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12