本发明属于细胞培养
技术领域：
，涉及一种成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法。
背景技术：
：树突状细胞(dendriticcells，dc)是1973年美国rockkflle大学steinman和cohn在观察脾脏细胞时发现的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。dc来源于造血干细胞，广泛分布在淋巴组织和非淋巴组织中，是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，其膜表面高表达mhc-ⅱ类分子，能有效刺激初始型t细胞活化，其抗原提呈能力远强于巨噬细胞和b细胞，因此，dc是机体免疫应答的主要启动者，在肿瘤免疫中亦发挥关键作用。国内外学者应用各种方法将dc进行处理，在体外扩增活化，并予以相应的抗原刺激以制成dc疫苗，然后回输至患者体内进行免疫治疗。体细胞治疗是指应用于人的自体或异体的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断和预防。目前临床中应用较为成熟的自体免疫细胞治疗技术是肿瘤生物治疗的重要方法之一，是在多种免疫活性因子的作用下，有效活化和扩增从自体外周血中分离的免疫活性细胞，回输入患者体内，直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞，或调节和增强机体的免疫功能。自体免疫细胞治疗技术包括细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗、树突状细胞免疫治疗、dc-cik细胞免疫治疗、自然杀伤细胞免疫治疗等。近年来，以树突状细胞为基础的肿瘤免疫治疗及dc疫苗已取得较大进展，体外制备的dc疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前景。目前，从外周血单个核细胞经gm-csf、il-4体外诱导培养dc的方法已基本得到公认，但dc体外促成熟的方案尚没有统一的标准，目前现有dc培养技术，dc得率低，活性低，刺激t细胞效率不够高，致使培养得到的dc功能缺陷，很大程度上限制了dc疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有dc培养方案进行进一步完善，以有效提高dc疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。技术实现要素：为了克服现有技术缺陷，本发明提供了一种成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法。本发明提供的dc培养方案能够有效提高dc的得率和活性，刺激ctl以后可有效提高ctl细胞的杀伤活性。本发明的具体方案如下所示：本发明提供了一种dc培养试剂，所述dc培养试剂包括成熟dc诱导剂、不成熟dc诱导剂、不成熟dc活化剂、icos抗体、抗原。进一步，所述成熟dc诱导剂包括gm-csf、il-4、tnf-α、pge-2。进一步，所述不成熟dc诱导剂包括gm-csf、il-4。进一步，所述不成熟dc活化剂包括flt3l、scf、klh。优选地，gm-csf浓度为50ng/ml，il-4浓度为50ng/ml，tnf-α浓度为10ng/ml，pge-2浓度为1μg/ml。优选地，flt3l浓度为50ng/ml，scf浓度为200ng/ml、klh浓度为50μg/ml。更进一步，所述成熟dc诱导剂和不成熟dc诱导剂还包括含有血浆的无血清培养基。在本发明的具体实施方案中，含有血浆的无血清培养基是含有1％自体血浆的aim-v培养基。本发明提供了一种成熟dc培养方法，所述培养方法包括如下步骤：(1)获取pbmc；(2)将pbmc诱导成不成熟dc，并活化不成熟dc；(3)将活化后的不成熟dc负载抗原和icos抗体；(4)利用前面所述的成熟dc诱导剂将步骤3获得的不成熟dc诱导成成熟dc。优选地，树突状细胞前体单核细胞来源于新鲜外周血，相比经过冷库储存或者培养传代之后的树突状细胞，从新鲜血液中制备的树突状细胞前体单核细胞离体时间较短，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持其免疫性能。在本发明中，树突状细胞前体单核细胞pbmc的具体获取过程为：单采机采外周血，75％酒精擦拭采血袋，放入生物安全柜内；将血转移入50ml离心管中，2200rpm离心10min，吸走血浆，加入pbs至原体积，将稀释后血液按体积比1:1缓缓加入到提前准备好的ficoll分离液上方，轻拿轻放不破坏上下层液面；离心机参数设置为升9降6，2000rpm，15min；离心完成后轻轻吸取白膜层，pbs离心清洗3次。前面所述的培养方法中步骤2的具体操作如下：a、培养瓶包被前面所述的不成熟dc活化剂；b、将pbmc接种到经步骤a处理的培养瓶中，加入前面所述的不成熟dc诱导剂培养。更进一步，步骤2的具体操作如下：取出提前隔夜4℃包被50ng/ml的flt3l，200ng/ml的scf、50μg/ml的klh的t175培养瓶，轻轻倒去pbs，将得到的pbmc加到培养瓶中，每瓶细胞数1.5*108，加入含有1％自体血浆、浓度为50ng/ml的gm-csf、浓度为50ng/ml的il-4的aim-v培养基，培养箱贴壁培养；培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mlaim-v培养基轻轻清洗培养瓶，加入配好的含有1％自体血浆、浓度为50ng/ml的gm-csf、浓度为50ng/ml的il-4的aim-v培养基30ml，培养箱培养2天。前面所述的培养方法中步骤3的具体操作如下：a、培养第3天，取出经步骤2获得的不成熟dc，拍打培养瓶，使尽量多的贴壁细胞漂浮；补加含有1％自体血浆、浓度为50ng/ml的gm-csf、浓度为50ng/ml的il-4的aim-v培养基30ml和抗原；b、培养第4天，取一个新的t75培养瓶，加入7mlpbs，加入icos抗体30μg/ml。前面所述的培养方法中步骤4的具体操作如下：培养第5天，取出经步骤3处理的不成熟dc，拍打培养瓶，将细胞收集到50ml离心管内；向培养瓶中加15ml冷pbs，置于4℃15min；取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮，将剩余细胞转入50ml离心管，1400rpm，5min，离心后将细胞转移入第4天包被的t75瓶，加入含有1％自体血浆、浓度为50ng/ml的gm-csf，浓度为50ng/ml的il-4，浓度为10ng/ml的tnf-α，浓度为1μg/ml的pge-2的aim-v培养基30ml培养。第7天，收获成熟大量高活性细胞。本发明还提供了根据前面所述的培养方法制备的成熟dc。本发明还提供了前面所述的dc培养试剂在前面所述的培养方法中的应用。本发明还提供了前面所述的dc培养试剂在制备成熟dc中的应用。本发明的优点和有益效果：与现有培养树突状细胞的方式相比，本发明通过不成熟dc诱导、不成熟dc活化、抗原和抗体负载、成熟dc诱导几个环节，有效促进树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈能力。本发明提供的dc培养方案能够有效提高dc的得率和活性，刺激ctl以后可有效提高ctl细胞的杀伤活性。具体实施方式为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1成熟dc培养本发明的成熟dc培养方法如下：1、单采机采外周血，75％酒精擦拭采血袋，放入生物安全柜内；2、将血转移入50ml离心管中，2200rpm离心10min，吸走血浆，加入pbs至原体积，将稀释后血液按体积比1:1缓缓加入到提前准备好的ficoll分离液上方，轻拿轻放不破坏上下层液面；3、离心机参数设置为升9降6，2000rpm，15min；4、离心完成后轻轻吸取白膜层，pbs离心清洗3次；5、取出提前隔夜4℃包被flt3l50ng/ml，scf200ng/ml(诱导高活性不成熟dc)、klh50μg/ml的t175培养瓶，轻轻倒去pbs，将得到的pbmc细胞加到培养瓶中，每瓶细胞数1.5*108，加入未成熟dc诱导剂(aim-v培养基，1％自体血浆，gm-csf浓度50ng/ml，il-4浓度50ng/ml)培养箱贴壁培养。其中，自体血浆的获取步骤参见公开号为cn109486762的专利文献；6、培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mlaim-v培养基轻轻清洗培养瓶，加入配好的未成熟dc诱导剂30ml，培养箱培养；7、第3天，取出培养瓶，拍打培养瓶，使尽量多的贴壁细胞漂浮。补加未成熟dc诱导剂30ml和提前准备好的抗原(如特异性肿瘤新抗原突变肽混合物)；8、第4天，取一个新的t75培养瓶，加入7mlpbs，加入可诱导共刺激分子(induciblecostimulate，icos)抗体30μg/ml(r&dsystems，货号：mab69753)；9、第5天，取出培养瓶，拍打培养瓶，将细胞收集到50ml离心管内。此时观察有大量细胞贴壁，向培养瓶中加15ml冷pbs，置于4℃15min。取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮，将剩余细胞转入50ml离心管，1400rpm，5min，离心后将细胞转移入第4天包被的t75瓶，加入30ml第一成熟dc诱导剂(aim-v培养基，含1％自体血浆，gm-csf浓度50ng/ml，il-4浓度50ng/ml，tnf-α浓度10ng/ml，pge-2浓度1μg/ml)；10、第7天，收获成熟大量高活性细胞。实施例2与传统成熟dc培养方法比较1、传统成熟dc培养方法如下：具体如下：1)密度梯度离心法制备pbmc；2)将pbmc铺于细胞培养瓶中放入co2培养箱中培养两小时，之后吸出未贴壁的悬浮细胞，并加入含有gm-csf和il-4的新鲜培养基继续培养；3)day3进行半量换液；4)day6进行半量换液，并添加促成熟因子混合物(pge-2，il-6，il-1β，tnf-α)；5)day8收获成熟mdc。2、比较成熟dc的表型和得率(1)采用流式细胞术检测本发明的培养方法制备的成熟dc和传统方法制备的成熟dc的表面表征物，并进行比较，结果如表1所示，结果表明本发明的培养方法制备的成熟dc更多。表1细胞表型分析方案(％)cd11c/cd14cd11c/cd83cd11c/cd86hla-dr/cd40hla-dr/cd80传统17.8768.8098.7386.7587.91改良13.1785.2799.6893.7793.89(2)本发明的培养方法和传统方法培养后dc的数量分析经过细胞计数，细胞数量和得率如表2所示，结果显示相比传统方法，本发明的dc培养方法大大提高了成熟dc细胞得率。表2细胞数和细胞得率统计方案细胞数得率％传统5.3×1063.5改良1.0×1076.7实施例3本发明的培养方法制备的成熟dc对ctl活性的影响1、ctl培养与激活1)培养第0天，取t25培养瓶，加入3ml包被液(humant-activatorcd3/cd28，货号：11161d)，置于培养箱中包被2h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的pbmc1.0×107，接种到t25培养瓶内，加15mlctl初始培养基(lonza，货号：04-418q)，加入ifn-γ终浓度为1000u/ml，置于37℃、5％co2培养箱中；2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-1α(浓度为1000u/ml)，il-2(浓度为1000u/ml)、il-12(浓度为20ng/ml)、il-7(浓度为50ng/ml)，上述物质的终浓度均为1000u/ml，将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中；3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加ctl培养基20ml(lonza，货号：04-418q)，置于37℃、5％co2培养箱中；4)培养第7天，将ctl细胞和根据实施例1的改进方法制备的成熟dc(用胰腺癌新抗原突变肽混合物负载dc)转移到t175中，加ctl培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中；5)培养第10天，将细胞转移到细胞培养袋中加入400mlctl培养基，置于37℃、5％co2培养箱中；6)培养第12天，收获细胞。2、激活后的ctl肿瘤杀伤作用检测利用cck8试剂盒(dojindo，ck04)进行cck8细胞杀伤实验，详细步骤如下：1)培养人胰腺癌细胞系bxpc-3，收获后用ctl培养基调整密度为1*105/ml；2)ctl收获后，调整密度分别为5*105/ml、1*106/ml和2*106/ml；3)实验分组：对照组：加入100μl肿瘤细胞和100μlctl培养基；实验组：按效靶比(ctl细胞：肿瘤细胞)5:1、10:1和20:1，分别加入100μl肿瘤细胞和100μl调整好浓度的ctl细胞；空白组：加入200μlctl培养基；在96孔板中共培养24h后，每孔加入10μlcck8染料培养2h；酶标仪检测吸光度a，根据检测结果计算肿瘤细胞的死亡率，得出ctl细胞对肿瘤细胞的抑制率[(a对照组-a实验组)/(a对照组-a空白组)]*100％。4)结果如表3所示。表3抑制率统计效靶比抑制率5:159.12％10:160.77％20:165.93％以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。当前第1页1 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