一种双特异性抗体及其抗肿瘤用途的制作方法

本发明涉及抗体药物领域，特别地涉及一种双特异性抗体及其抗肿瘤用途。

背景技术：

目前已经有数十种单克隆抗体药物被相关机构认证并且运用到了临床抗肿瘤治疗中，虽然它们给肿瘤免疫治疗带来了突破性的成效，但是其疗效往往有限，如其中一些会产生耐药性，从而导致部分患者用药后不响应，或是在初始响应后出现复发再进展。普通的肿瘤治疗性抗体只能结合单一的抗原，其结合特异性相对较低，容易发生脱靶效应。

双特异性抗体(bispecificantibody，bsab)能分别识别和结合两种不同的抗原，所以它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上，进而增强对靶细胞的杀伤作用，同时它也可以结合同一肿瘤细胞上的不同抗原以增强其结合特异性，从而减少脱靶毒性等副作用。这种具有双功能的重组抗体作为治疗肿瘤的药物拥有比单抗药物更高的疗效。

1986年，staerz和bevan第一次利用双特异性抗体把细胞毒性t淋巴细胞运用于癌细胞溶解实验。2014年12月，安进公司研发的双特异性抗体免疫治疗药物blinatumomab用于复发性或难治性的费城染色体阴性前b细胞急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，all)的治疗。

随着全球环境的恶化和人们生活习惯的改变，肿瘤的发病率越来越高，肿瘤患者的死亡率也逐渐上升，故抗肿瘤药物的市场将不断扩大。随着科学研究技术的发展，可以通过改变双特异性抗体的结构、相对分子质量和化合价来改善其血浆清除率、组织渗透率和药物代谢动力学等，进而提高其成药稳定性和临床疗效。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种双特异性抗体及其抗肿瘤用途。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种双特异性抗体，所述抗体包含能与tim-3特异性结合的第一抗原结合功能区和能与vista特异性结合的第二抗原结合功能区。

进一步地，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列是与seqidno.7、9、10、11所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。

进一步地，所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列是与seqidno.8、12、13、14所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。

进一步地，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.7、9、10、11任一项所示和/或所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.8、12、13、14任一项所示。

进一步地，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.11所示，所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.14所示。

进一步地，所述第一抗原结合功能区的重链的氨基酸序列如seqidno.17所示，所述第一抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.18所示。

进一步地，所述双特异抗体的fc链为igg形式。

进一步地，所述抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab)'2、单链fv(scfv)和双特异性抗体。

进一步地，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有上述抗体相应核苷酸编码序列的宿主细胞，收集细胞，纯化双特异性抗体或其他等同生产方案。

进一步地，所述双特异性抗体可以与至少一种治疗剂偶联以形成免疫偶联物，所述治疗剂选自细胞毒素剂、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。

进一步地，包括从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的上述抗体及其抗原结合片段并与药学上可接受的载体制成药物用于治疗肿瘤的用途，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌。

t细胞活化的v域免疫抑制因子(vista)是一种新型的抑制性免疫检查点蛋白。vista在肿瘤细胞上的表达及其相关调控机制尚不清楚。已有研究表明vista在人类卵巢癌和子宫内膜癌中高度表达。vista在子宫内膜癌中的上调与vista启动子甲基化状态有关。vista在肿瘤细胞中抑制t细胞增殖和细胞因子的产生，并在体内减少肿瘤浸润的cd8+t细胞。抗vista抗体延长荷瘤小鼠的存活时间。

代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。

抗体的结合特异性及亲合力均主要由cdr序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非cdr区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。

“可变区”是指在抗体间，可变区的某些区段的序列显著不同，所述高度可变区为各3-12个氨基酸，其主要采取β折叠构型，由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由fr紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))，恒定区不直接涉及抗体对抗原的结合。

“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个cdr域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个cdr域。

“抗体的抗原结合片段”可以是单条多肽链(例如，scfv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、fab片段、fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。

“igg”是免疫球蛋白g(immunoglobuling，igg)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据igg分子中的r链抗原性差异，人igg有四个亚型：igg1、igg2、igg3、igg4。

“单克隆抗体”是指获得自大体上均质的抗体的群体的抗体，即组成该群体的抗体除了个别抗体可少量存在的可能天然生成的突变外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，是指针对单一抗原位点。此外，相对于包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。除单克隆抗体的特异性外，单克隆抗体的有利的处在于其可经合成而不被其他抗体污染。

一个或多个二硫键链间连接是指第一fc链及第二fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一fc链及第二fc链或者第一fc链及第二fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一fc链及第二fc链或者第一fc链及第二fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。

本发明的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、噬菌体展示系统、酵母、植物细胞、动物细胞。

“治疗”包括但不限于以下中的一项或更多项试验表征：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；预防或延迟疾病的恶化；预防或延迟疾病的扩散；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。在本发明中“治疗”可以解释为癌症的病理结果(例如肿瘤体积的减小)。

药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。

附图说明

图1显示了抗tim-3/vista双特异性抗体的tim-3、vista同时结合活性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：

用6-8周龄雌性balb/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)作为实验动物进行小鼠免疫试验。初次免疫使用50μg人vista蛋白(购自北京义翘神州)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按1ml/只注射量注射小鼠腹腔，每隔2周用25μg人vista蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液进行加强免疫，加强免疫三次，末次免疫1周后，收集小鼠静脉血并分离血清，通过elisa方法测量抗体效价并选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。

收集对数生长的骨髓瘤细胞(sp2/0)制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5-1:10的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤后离心8分钟弃上清，将细胞沉淀置于40℃水浴中预热，向细胞沉淀中加入预热至40℃的peg-4000溶液1ml，出现颗粒后1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基以终止反应。静置后加入2mlhat培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充hat培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1.5×10⁷/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养并观察，待细胞表面积达到孔板面积1/2以上时，吸出上清液样品供抗体检测。

实施例2：

筛选杂交瘤培养上清液的抗人vista抗体。具体地，用缓冲液在96孔高吸附酶标板上包被人vista(购自北京义翘神州)，包被量100μl每孔，之后用缓冲液洗涤3次后；用含1％bsa的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μl/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μl上清液样品(s1-s85)以及阳性血清(对照，ck1-5)，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μl以比例1/10000稀释于含1％bsa缓冲液里的抗小鼠igg抗体，所述抗小鼠igg抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μl比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据od450nm的强弱选取能够分泌人vista结合抗体的阳性克隆。

实施例3：

将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体dna序列的测定。首先按照说明书使用rnapreppure试剂盒(tiangen)提取细胞mrna。之后使用quantscriptrt试剂盒(tiangen)合成cdna第一链。将逆转录产生的cdna第一链用于后续pcr反应，将pcr扩增得到的目的条带克隆到pgem-t载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。

经过pcr扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区cdr-l1氨基酸序列如seqidno:1；cdr-l2氨基酸序列如seqidno:2、cdr-l3的氨基酸序列如seqidno:3所示；重链的三个互补决定区cdr-h1氨基酸序列如seqidno:4、cdr-h2氨基酸序列如seqidno:5、cdr-h3氨基酸序列如seqidno:6所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源igvh4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源igvh2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体tl10-11中(载体骨架pegfp-n1，购自上海吉满生物)。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293f细胞系(购自上海纪宁生物科技)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为2×10⁸细胞/ml。按照转染体积加入质粒，终浓度为45.2μg/ml，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为50μg/ml。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。

实施例4：

检测实施例1获得的抗人vista鼠源单抗(以下简称om-anti-vista)与其抗原结合的动力学常数。利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离，简要地，将om-anti-vista溶于的醋酸钠缓冲溶液(ph5.0)中并偶联到cm芯片上，用1m乙醇胺封闭，结合阶段将不同浓度的om-anti-vista以25μl/min的速度注入3.0min，在解离阶段用pbs缓冲溶液以25μl/min的速度注入5.0min，结合动力学常数和解离动力学常数通过biacore3000软件进行分析计算。om-anti-vista的结合动力学常数为2.14e+05(1/ms)、解离动力学常数为3.61e-05(1/s)、解离平衡常数为1.68e-09(m)。

实施例5：检测鼠源单抗体内中和活性

测定om-anti-vista的体内中和活性。简要地，选用6-8周龄雌性balb/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。随机分成五组，每组6只，静脉注射并单次给药，每组剂量水平分别为0.5nmol/kg,5nmol/kg，15nmol/kg，25nmol/kg，50nmol/kgom-anti-vista。给药一小时后，给每只小鼠皮下注射人vista蛋白15μg，注射2小时后，对各小鼠进行眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样约40分钟左右至凝血，离心获取血清样品，采用cckelisa试剂盒按说明书测定血清中小鼠cck的浓度，结果表明25nmol/kgom-anti-vista能够抑制人vista刺激小鼠分泌的cck的水平，基本能将小鼠cck水平降低至未刺激状态。

实施例6：

测定om-anti-vista的在大鼠体内的药代动力。简要地，选用6-8周龄雌性sd大鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。取大鼠5只，分别给予25nmol/kgom-anti-vista。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。elisa测定血清中om-anti-vista含量，测试结果表明，单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的om-anti-vista的药代参数如下：半衰期为498小时；药时曲线下面积为43721nm.hr；估算零浓度为391nm；表观分布容积为119ml/kg；清除率为0.178ml/hr/kg；平均驻留时间为163小时。

实施例7：

人源化形式的抗人vista抗体参考moleculeimmunol的制备方法制备，在germline数据库中选取与om-anti-vista非cdr区匹配最好的人源化模板，其中重链可变区的模板为人源igvh4-28*03，轻链可变区的模板为人源igkv1-16*02，将鼠源抗体cdr区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如seqidno:7所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如seqidno:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(vh)及轻链可变区氨基酸序列(vl)如表1所示。

表1.回复突变获得的氨基酸序列

将人源化的抗人vista单抗的重链可变区(seqidno：7-11)分别与人抗体igg1重链恒定区(seqidno:15)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人vista单抗的轻链可变区(seqidno：8-14)分别与人抗体kappa轻链的恒定区(seqidno:16)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入tl10-11(载体骨架pegfp-n1)载体中。

实施例8:

构建分别含抗人tim-3的抗体的重链(氨基酸序列如seqidno：17所示)和轻链(氨基酸序列如seqidno：18所示)的tl10-11表达载体，其中抗体可变区序列来源于http://www.imgt.org/3dstructure-db/cgi/details.cgi？pdbcode＝9798，通过pcr的方法分别扩增轻链可变区以及轻链恒定区，重链可变区以及重链恒定区，pcr引物根据碱基互补原则以及酶切位点的需要进行常规设计。获得抗人tim-3抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人tim-3抗体的重链和轻链。

分别构建抗人vista的抗体的重链和轻链的tl10-11表达载体(重链氨基酸序列如seqidno:11所示，轻链氨基酸序列如seqidno:14所示)，根据常规方法，获得抗人vista抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人vista抗体的重链和轻链。

实施例9：

本发明参考wo2013060867中描述的一种大规模生产异二聚体双特异抗体的方法，该方法先还原两种混合的同源二聚体形式抗体，然后通过在这两种同源二聚体抗体的fc区引入不对称氨基酸突变从而促使不同抗体的fab臂发生交换，最后通过氧化铰链区的链间二硫键形成稳定的双特异抗体。

分别将含抗人tim-3抗体的重链和轻链的表达载体转染293f细胞，另外分别将含抗人vista抗体的重链和轻链的表达载体也转染293f细胞。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的293表达培养基中，细胞密度为1.5x10⁷细胞/ml。按照转染体积加入质粒，终浓度为31.12ug/ml，轻轻混匀；然后加入线性pei至终浓度为45ug/ml，轻轻混匀。之后放入细胞培养箱，摇床37℃培养1小时。之后加入20倍转染体积的新鲜培养基，继续摇床37℃培养，通过elisa的方法测定抗tim-3/vista双特异性抗体的表达量，蛋白纯化由武汉普健生物完成。

实施例10：

检测获得实施例9获得的双特异性抗体与抗原vista，抗原tim-3的结合的动力学常数，方法同实施例4，双特异性抗体的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。

表2.双特异性抗体与其与其抗原结合的动力学常数

测定双特异性抗体在大鼠体内的药代动力，简要地，选6-8周龄雌性sd大鼠随机分成2组(编号测试组1，测试组2，每组5只)，测试组1给予20nmol/kg双特异性抗体；测试组2给予40nmol/kg双特异性抗体。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45min至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。

单次静脉注射的剂量为20nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t1/2为36小时，药时曲线下面积auclast为27463nm.hr，估算零浓度c0为84nm，表观分布容积vd为37ml/kg，清除率cl为0.73ml/hr/kg，平均驻留时间mrtlast为68小时。

单次静脉注射的剂量为40nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t1/2为56小时，药时曲线下面积auclast为31124nm.hr，估算零浓度c0为87nm，表观分布容积vd为41ml/kg，清除率cl为0.84ml/hr/kg，平均驻留时间mrtlast为79小时。

实施例11：

用酶联免疫吸附试验(elisa)测定抗tim-3/vista双特异性抗体的双靶点的结合活性，方法同实施例2。简要地，用碳酸盐缓冲溶液(ph9.3)在96孔高吸附酶标板上包被重组人vista(浓度1μg/ml，100μl)，4℃过夜；pbst洗涤5次后用pbst(含1％bsa)封闭孔(280μl/孔)，25℃孵育1h；pbst洗涤5次后加入稀释在pbst(含1％bsa)的双特异性抗体样品以及对照(100μl)，25℃孵育1h，pbst洗涤5次，然后加入稀释的生物素标记的tim-3-fc(0.5μg/ml，每孔100μl)，25℃孵育1h，加稀释在的pbst里的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(1:1000)，每孔100μl，25℃孵育1h，pbst洗涤5次，加入比色底物tmb，100μl/孔，室温显色10min。加入h2so4(1m,100μl/孔)终止显色，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，结果如图1所示，tim-3单抗和vista单抗的组合不能同时结合tim-3、vista，只有抗tim-3/vista双特异性抗体具有同时结合两种抗原的活性。

实施例12：

检测抗人vista人源化单抗(vislc18)，抗人tim-3人源化单抗，双特异性抗体对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(balb/c-nu背景，上海加科生物科技有限公司)。取25只小鼠，每只右腋下植入胰腺癌细胞株(购自上海煊翎生物科技有限公司，货号f0677)，待小鼠明显荷瘤切片验证，模型荷瘤小鼠模型构建，观察肿瘤生长并记录肿瘤体积，每周给药2次(腹腔注射)，连续给药5周，自给药之日起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(axb²)/2。

待小鼠肿瘤体积增至所需体积，按体积分组每组5只：vt1,vt2,vt3,vt4,vt5(体积约200mm³)；vt6,vt7,vt8,vt9,vt10(体积约150mm³)；vt1,vt6设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，vt2,vt7给药25nmol/kg抗人vista人源化单抗，vt3,vt8给药25nmol/kg抗人tim-3单抗，vt4,vt9给药剂量为20nmol/kg双特异性抗体，vt5,vt10给药剂量为40nmol/kg双特异性抗体，试验结果如表3所示。

表3.试验小鼠肿瘤消融比

由表3可见，双特异性抗体相较于抗人vista人源化单抗和tim-3在肿瘤消融比例上有显著提高，尤其是给药较高浓度双特异性抗体(40nmol/kg)时，5周时间的肿瘤消融比例高达17.90％，由此可见，本发明提供的双特异性抗体在小鼠实验中具有明显抗肿瘤活性，显著抑制了小鼠移植瘤的生长，双特异性抗体针对中等体积肿瘤(约150mm³)消融效果更佳，即在癌症中前期的抑制效果更为显著。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110>杨彪

<120>一种双特异性抗体及其抗肿瘤用途

<160>18

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<210>1

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225230235240

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245250255

serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu

260265270

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275280285

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glucys

225