一种脱氮菌株及微生物菌剂和应用的制作方法

本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种脱氮菌株及微生物菌剂和应用。

背景技术：

传统的生物脱氮过程为硝化-反硝化生物脱氮过程，硝化作用是指在硝化细菌的作用下，氨氮首先转化为亚硝态氮，之后再转化为硝态氮，反硝化过程是指在反硝化脱氮菌的作用下，硝态氮或者亚硝态氮转变为氮气等气态物质脱离水体，从而达到水体脱氮的目的。由于硝化作用需要在好氧条件下进行，反硝化脱氮过程需要在缺氧条件下进行，故传统的脱氮工艺通常是将硝化、反硝化设置在不同的构筑物中进行反应，因此，传统的生物脱氮工艺存在基建费用高、处理工艺流程长等不足。所以，一些新型高效的脱氮微生物菌种的发现和应用，必将会促进传统生物脱氮工艺效率的提升及新型生物脱氮工艺的研究和应用。

此外，在高耐高浓度硝态氮、亚硝态氮存在情况下，使用正常的生物处理方法，需要较长的周期完成生物脱氮反应，因此，获得高浓度硝态氮耐受能力降解菌株，对于处理实际废水，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种脱氮菌株及微生物菌剂和应用，本发明脱氮菌株兼具异氧硝化和好氧反硝化能力，能够高效降解含氮污水中的亚硝态氮、硝态氮以及氨氮，且耐受高达2500mg/l的硝态氮浓度，适用于高浓度含氮废水的生物处理。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种脱氮菌株，所述脱氮菌株为枯草芽孢杆菌zl-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.20555；保藏时间为2020年08月26日。

优选地，所述脱氮菌株的16srrna基因序列如seqidno：1所示。

本发明第二方面提供一种含有所述脱氮菌株的微生物菌剂。

优选地，所述微生物菌剂为将所述脱氮菌株接种于培养基中进行培养得到。

优选地，所述培养基中碳源为乙酸钠，氮源为氯化铵、硝酸钾或亚硝酸钠。

本发明第三方面提供一种所述脱氮菌株或所述微生物菌剂在含氮废水的脱氮处理中的应用。

本发明第四方面提供一种含氮废水的脱氮处理方法，所述脱氮处理方法包括如下步骤：

将所述脱氮菌株或所述微生物菌剂接入含氮废水中进行生物脱氮。

优选地，所述生物脱氮过程中控制废水温度为25～35℃。

优选地，所述生物脱氮过程中控制废水ph值为6～9。

优选地，所述含氮废水中亚硝态氮或硝态氮的总浓度不高于2500mg/l。。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明脱氮菌株兼具异氧硝化和好氧反硝化能力，能够高效降解含氮污水中的亚硝态氮、硝态氮以及氨氮，且耐受高达2500mg/l的硝态氮及亚硝态氮浓度，适用于高浓度含氮废水的生物处理。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例2中不同硝态氮浓度条件下枯草芽孢杆菌zl-1对硝态氮的降解率及菌株浓度的影响；

图2为本发明实施例2中枯草芽孢杆菌zl-1在硝态氮2000mg/l条件下对硝态氮的降解曲线；

图3为本发明实施例3中不同亚硝态氮浓度条件下枯草芽孢杆菌zl-1对亚硝态氮的降解率及菌株浓度的影响；

图4为本发明实施例3中枯草芽孢杆菌kk-1在亚硝态氮2000mg/l条件下对亚硝态氮的降解曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

本实施例为枯草芽孢杆菌zl-1菌株的分离和鉴定

(a)采用富集培养法从北京某市政污水处理厂缺氧反硝化池中分离得到，具体步骤如下：

(1)配制培养基：在250ml三角瓶中装入100ml硝态氮无机盐培养基混合体系，其中包括培养基溶液、无机盐微量元素溶液和硝酸钾。每1l培养基中加入1.2ml微量元素溶液，120℃灭菌30min。

培养基溶液为(g/l)：5gch3coona、1gkh2po4、1gk2hpo4·3h2o、0.2gmgso4·7h2o；微量元素溶液为(g/l)：1gfeso4·7h2o，1gmnso4·h2o，0.25gna2moo4·2h2o，0.1gh3bo4，0.25gcucl2·2h2o，0.25gzncl2，0.1gnh4·vo3，0.25gco(no3)2·6h2o，0.1gniso4·6h2o，溶解于900ml蒸馏水中，加5ml浓h2so4，补蒸馏水至1000ml。

(2)驯化培养：向培养基中接入5ml从北京某市政污水处理厂采集的缺氧反硝化池活性污泥，于30℃在转速200r/min的摇床中振荡培养2至3d，取5ml菌液接种到100ml新培养基中，重复转接6次。新培养基中亚硝态氮的浓度依次递增。起始浓度为500mg/l，以后每次转接亚硝态氮浓度增加500mg/l，直至第6次转接的3500mg/l。

(3)分离纯化：驯化培养好的菌液按10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释，取0.1ml各浓度稀释液分别涂在含有2000mg/l亚硝态氮的培养基平板上，35℃倒置培养3至5天，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化，得到纯化的菌株zl-1。

(b)采用16srrna基因测序法对zl-1菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：

(1)细菌总dna的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取zl-1菌株的基因组dna，作为pcr反应的模板。

(2)16srrna基因的rcr扩增：

使用如下扩增引物

27f:5’-agagtttgatcmtggctcag-3’[m＝c,a]

1492r:5’-cggytaccttgttacgactt-3’[y＝t,c]

中间引物：533f:5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3

pcr反应体系如下表所示：

pcr反应条件为：(94℃3min)→(94℃1min→55℃0.5min→72℃1min)×30个循环→(72℃1min)。

(4)pcr产物的纯化、克隆、测序和分析；

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pmd18-t载体连接，转化到大肠杆菌dh5α，然后提取重组质粒，测定16srrna基因序列，具体基因序列如seqidno：1所示。将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列blast比对，得到与相关菌株的16srrna基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明zl-1菌株与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的16srrna基因序列的同源性在99％以上，因此将分离菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。

(c)枯草芽孢杆菌zl-1菌株的形态鉴定特征如下：

革兰氏阳性菌，菌落白色不透明、隆起、边缘光滑齐整，菌株在生长过程中能耐受2500mg/l的硝态氮或亚硝态氮，最适生长条件为：ph7.0～8.0，温度30℃。

实施例2

枯草芽孢杆菌zl-1对不同浓度的硝态氮降解率及菌体浓度(od600值)

在ph7.0，温度30℃，硝态氮初始浓度分别为500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l、3500mg/l，将枯草芽孢杆菌zl-1菌株的培养物接种于100ml上述以硝酸钾为唯一氮源的培养基中，200r/min振荡培养48h后取样。

采用紫外分光光度法，测定样品中残留硝态氮含量，计算降解率。以硝态氮初始浓度为横坐标，以硝态氮降解率及od600值(菌体浓度)为纵坐标，绘制降解及菌体浓度曲线，结果如图1所示。

由图1可见，枯草芽孢杆菌zl-1在硝态氮浓度低于2000mg/l时，对硝态氮有很好的降解效果，降解率可达到99％以上；在硝态氮浓度高达2500mg/l时，降解率仍可以达到90％以上；而当硝态氮初始浓度高于3000mg/l时，枯草芽孢杆菌zl-1对硝态氮的降解率逐渐降低，但仍有一定的降解能力。

采用紫外分光光度法，测定样品中残留的硝态氮含量，以时间为横坐标，硝态氮残留浓度为纵坐标，绘制降解曲线，结果如图2所示。

由图2可见，培养基初始硝态氮浓度为2000mg/l时，本发明的枯草芽孢杆菌zl-1可在48h内，将培养基中硝态氮降解99％以上，最终培养液中硝态氮浓度低于1mg/l。

实施例3

枯草芽孢杆菌zl-1对不同浓度的亚硝态氮降解率及菌体浓度(od600值)

在ph7.0，温度30℃，亚硝态氮初始浓度分别为500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l、3500mg/l，将枯草芽孢杆菌zl-1菌株的培养物接种于100ml上述以亚硝酸钠为唯一氮源的培养基中，200r/min振荡培养48h后取样。

采用紫外分光光度法，测定样品中残留亚硝态氮含量，计算降解率。以亚硝态氮初始浓度为横坐标，以亚硝态氮降解率及od600值(菌体浓度)为纵坐标，绘制降解及菌体浓度曲线，结果如图3所示。

由图3可见，枯草芽孢杆菌zl-1在亚硝态氮浓度低于2000mg/l时，对亚硝态氮有很好的降解效果，降解率可达到99％以上；在亚硝态氮浓度高达2500mg/l时，降解率仍可以达到90％以上；而当亚硝态氮初始浓度高于3000mg/l时，枯草芽孢杆菌zl-1对亚硝态氮的降解率逐渐降低，但仍有一定的降解能力。

采用紫外分光光度法，测定样品中残留的亚硝态氮含量，以时间为横坐标，亚硝态氮残留浓度为纵坐标，绘制降解曲线，结果如图4所示。

由图4可见，培养基初始亚硝态氮浓度为2000mg/l时，本发明的枯草芽孢杆菌zl-1可在48h内，将培养基中亚硝态氮降解99％以上，最终培养液中亚硝态氮浓度低于1mg/l。

实施例4

枯草芽孢杆菌zl-1对氨氮的降解情况

在ph7.0，温度30℃，氨氮初始浓度为1000mg/l，将枯草芽孢杆菌zl-1菌株的培养物接种于100ml上述以氯化铵为唯一氮源的培养基中，200r/min振荡培养48h，

采用紫外分光光度法，测定样品中残留氨氮含量，计算降解率；计算结果为氨氮残留量为1mg/l，氨氮去除率达到99％。

本发明的枯草芽孢杆菌zl-1可以被用于处理含亚硝态氮、硝态氮溶液以及氨氮溶液，以降解其中的亚硝态氮、硝态氮和氨氮，例如可以用于生物处理含亚硝态氮、硝态氮和氨氮的工业废水。枯草芽孢杆菌zl-1可以高效降解亚硝态氮、硝态氮和氨氮，在以亚硝态氮、硝态氮为氮源(例如亚硝酸钠或硝酸钾浓度为5g/l)、乙酸钠为碳源(例如浓度为10g/l)的培养液体培养基中接种该枯草芽孢杆菌zl-1后，30℃，ph＝6～10范围内可高效降解亚硝态氮、硝态氮，48h亚硝态氮、硝态氮降解率达到99％以上。

具体的应用方法为：在以乙酸钠为碳源、亚硝酸钠或硝酸钾为氮源的液体培养基中，将枯草芽孢杆菌zl-1于25～35℃振荡培养36～60h，然后将菌液接种到亚硝态氮和硝态氮总含量低于2500mg/l的废水中(例如，可以按5％～10％的接种量接种)，于25～35℃振荡培养48h以后，可以去除90％以上的硝态氮及亚硝态氮。

下面通过三个应用实施例(实施例5～7)进一步详细阐述本发明的枯草芽孢杆菌zl-1在处理含亚硝态氮、硝态氮溶液、氨氮溶液(在这些实施例中为含亚硝态氮、硝态氮和氨氮废水)中的应用。

实施例5

枯草芽孢杆菌zl-1菌株在含硝态氮工业废水处理中的应用

将枯草芽孢杆菌zl-1在以乙酸钠为碳源(10g/l)、硝酸钾为氮源(5g/l)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到硝态氮含量为1100mg/l的某化工厂废水中，30℃振荡培养48h，硝态氮残留量为1mg/l，硝态氮去除率达到99％。

而不添加枯草芽孢杆菌zl-1的对照组硝态氮残留量为870mg/l，硝态氮去除率仅为21％。

实施例6

枯草芽孢杆菌zl-1菌株在含亚硝态氮工业废水处理中的应用

将枯草芽孢杆菌zl-1在以乙酸钠为碳源(10g/l)、亚硝酸钾为氮源(5g/l)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养48h，然后按10％的接种量将菌液接种到亚硝态氮含量为2500mg/l的某发酵车间生产废水中，30℃振荡培养48h，亚硝态氮残留量为240mg/l，亚硝态氮去除率达到90％。

而不添加枯草芽孢杆菌zl-1的对照组亚硝态氮残留量为1800mg/l，亚硝态氮去除率仅为28％。

实施例7：

枯草芽孢杆菌zl-1菌株在含氮工业废水处理中的应用

将枯草芽孢杆菌zl-1在以乙酸钠为碳源(10g/l)、硝酸钾为氮源(5g/l)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到氨氮含量291mg/l、亚硝态氮含量356mg/l、硝态氮含量为460mg/l，总氮含量为1400mg/l的某精细化工品生产废水中，30℃振荡培养48h，总氮残留量为5mg/l，总氮去除率达到99％。

而不添加枯草芽孢杆菌zl-1的对照组总氮残留量为360mg/l，总氮去除率仅为26％。

综上，本发明要求保护的枯草芽孢杆菌zl-1菌株，以及含有该菌株的微生物菌剂可高效降解亚硝态氮、硝态氮和氨氮，将枯草芽孢杆菌zl-1菌株，以及含有该菌株的微生物菌剂应用于处理含高浓度亚硝态氮、硝态氮或氨氮的废水中，可以解决现有技术中，在生物处理含高浓度亚硝态氮、硝态氮实际废水时，硝态氮、硝态氮降解率低的问题；此外，本发明的枯草芽孢杆菌zl-1菌株能耐受高达2500mg/l亚硝态氮、硝态氮，并且在2000mg/l硝态氮、硝态氮亚溶液中能高效降解亚硝态氮、硝态氮，且同时可降解氨氮，这对于生物处理含氮废水具有重要的实际意义。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

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