一种亲水性超大孔聚合物微球及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高分子微球制备领域，特别涉及一种亲水性超大孔聚合物微球及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 色谱技术到目前为止仍然是高效分离蛋白质、质粒等生物大分子的一种有效手 段。选择一种合适的分离介质是保证分离效率的关键因素。由于生物大分子空间三四级结 构复杂，尺寸大(蛋白质分子直径通常为I-IOOnm,质粒分子直径则在150-250nm之间)，稳 定性差等特点。为了保持生物大分子的生物活性，要求在保证分离纯度的前提下尽可能的 缩短分离时间，以减少生物大分子被流体切割的程度（PerfusiveChromatography, USPate nt5, 833, 861，1998)，同时要求分离介质孔径要与生物大分子体积相适应，一般要大于溶质 分子直径10 - 20倍（Polymer, 2007, 48:1981-1988)，否则分子扩散会受到限制。传统的色 谱分离介质孔径通常在l〇_5〇nm之间，生物大分子只能吸附在微球外表面，不能有效利用 微球的孔道和表面积，传质速率慢，分离效率低下，已成为现代生物技术发展的一个限制因 素。此外，目前占主流的多糖类分离介质还存在机械强度低，只能在低流速下操作的缺陷。 超大孔聚合物微球的出现为解决该问题提供了有效思路。
[0003] 超大孔聚合物微球机械强度高，化学性质稳定，近年来引起研究人员的广泛兴趣。 上世纪90年代初出现的灌注色谱介质（POROS)就是一种超大孔聚苯乙烯（PS)微球，已 成功用于蛋白质的快速分离（Perfusionchromatography. Nature, 1991，350:634-635; J. Chromatogr. A，1996, 743:221-229)，具有操作压强低、流速快、产量大等优点。P0R0S介质 具有两类孔，一类是600-800nm的贯穿孔（through pores),另一类是80-150nm的扩散孔 (diffusive pores)。贯穿孔内流体可以对流形式流动，传质速度快；而扩散孔提供了足够 高的比表面积，保证了介质的吸附容量。但由于该类介质制备工艺复杂，微球孔道的形成不 易控制，批次重复性差，并且纳米颗粒间结合力弱，介质在装柱过程中容易破碎，很难工艺 放大进行大规模生产，以上问题使P0R0S介质的应用停滞不前，近年来少有P0R0S介质的应 用报道。
[0004] Magnapore 微球是另一种超大孔微球（PolymericMicrobeads. USPatent5, 863, 957, 1999)，它的特点是孔道非常规整，孔径较大（1-50 μ m)，相互联通的孔 明显可见。Magnapore微球是米用高内相乳液法（high internal phase emulsion, HIPE) 制备的，在制备过程中，由于HIPE内相的体积浓度高达80-90%，乳液的稳定性是制备的 一个难点。同时，HIPE粘度很高，在外水相分散性不好，成球率低，球体大小不均匀，并且 Maganopore介质的大孔径造成比表面积很低（2-30m2/g)，孔壁很薄机械强度不够高，容易 破碎，无法在大规模制备色谱上应用。天津大学孙彦以无机颗粒为致孔剂制备出孔径约为 500nm的球形介质（Biotechnol. Prog, 2003, 19, 1300-1306)，制备的超大孔介质在分离应 用中效果较好。他们发现要得到贯穿的大孔径，无机颗粒的体积含量应为10-40%。然而，有 机高分子材料与无机颗粒之间的相容性差，要用有机高分子材料完全将大量的无机颗粒包 埋在内，是一个难题。
[0005] 专利号为200510087138. 0的专利《一种超大孔聚合物微球的制备方法及其产 品》，为中国科学院过程工程研究所的马光辉等人利用表面活性剂反胶团溶胀法制备了孔 径达300-500nm左右的超大孔聚苯乙烯微球（Polymer, 2007,48:1981-1988)，这种方法 简单方便，重复性好，容易放大生产。但是制备过程中需要大量的表面活性剂(表面活性 剂的加入量达到单体量的40%)，为微球后续处理带来麻烦，并且制备得到的超大孔聚苯 乙烯微球，由于疏水性较强对蛋白质等生物大分子存在非特异性吸附，在实际应用中会 使生物大分子产生不可逆吸附而变性失活。同时聚苯乙烯表面缺乏能进一步衍生的功能 基团，需要进行亲水改性才能作为色谱基质应用（Langmuir，2008, 24(23) : 13646-13652 ; J. Chromatogr. A.，2009, 1216:6511-6516)。最近该研究所又报道了一种采用双乳液模板 法制备具有微米级贯穿孔微球的方法（Colloid Polym Sci，2013, 291:117-126)。他们采 用线性聚合物作为高分子材料，聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为表面活性剂，采用均质 乳化方法得到复乳，然后通过溶剂提取固化。微球的直径在30-100 μ m之间，表面孔径在 0. 5-90 μ m之间。但是，这种制备微球的方法虽然方便，但是由于没有交联，微球强度较差， 用作色谱分离介质有一定的局限性。
【发明内容】
[0006] 本发明克服了上述方法的不足，采用自制的双亲性两嵌段含糖大分子单体作为表 面活性剂，通过悬浮聚合法制备微球。双亲性两嵌段大分子单体会在油相中形成反胶团，进 一步吸水溶胀得到连续相乳液，升温聚合时水相和聚合物发生相分离形成超大孔。由于在 吸水溶胀过程中亲水性链段会自发排列在面向水通道的微球的外表面，疏水性链段则通过 双键参与聚合反应结合到微球骨架内部，从而一步实现了超大孔聚合物微球的制备和表面 亲水改性(见附图1)。该亲水性超大孔聚合物微球在酶固定化和蛋白质快速分离纯化领域 有广泛的应用空间。
[0007] 本发明所采用的技术方案是：
[0008] -种亲水性超大孔聚合物微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0009] (1)以含糖单体或乙酸乙烯酯为单体，采用原子转移自由基聚合方法（ATRP) 或电子活化再生原子转移自由基聚合方法（AGET-ATRP)制备线性聚合物，反应温度为 IO-KKTC ;反应时间为0. 5-6h ;单体浓度0. 1-10M，单体与引发剂的摩尔比范围为10:1? 200:1，催化剂的加入量与引发剂相同，配体的加入量为催化剂的0. 5-3倍，反应溶剂可选 甲苯、黎芦醚、苯甲醚、溴苯、氯苯等有机溶剂的一种；反应后用四氢呋喃（THF)或三氯甲烷 稀释反应产物并过氧化铝柱除去催化剂，得到的无色溶液在甲醇中（当单体为乙酸乙烯酯 时可用正己烷沉淀）沉淀两次，室温下抽滤，真空干燥后进入步骤（2);
[0010] (2)以步骤（1)所得的线性聚合物作为大分子引发剂，苯乙烯为单体，