)取步骤(2)的葡萄糖溶液2.0mL加入到灭过菌的步骤(I)的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基。
[0055]2、摇瓶发酵培养
[0056]A、斜面种子活化
[0057]取斜面保存的粉状毕赤酵母ACCC21153在YEH)培养基平板上划线，置28°C培养箱倒置培养24h，出现游离单菌落。
[0058]B、摇瓶种子制备
[0059]用接种环取一环步骤A的活化种子的单菌落，接入装有30mL YEPD培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L)的250mL三角瓶中，在28°C条件下，150r/min下振荡培养，当菌体0D_达到10.0?12.0时即得摇瓶种子(粉状毕赤酵母ACCC21153在YEH)培养基中的种子液生长曲线见附图1)。
[0060]C、发酵培养
[0061]将摇瓶种子液按3%的接种量接入装有30mL步骤I制备的粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的250mL摇瓶中，控制摇床温度28°C，转速180r/min，发酵至24h结束，此时粉状毕赤酵母ACCC21153的有效活菌数为12.7亿/mL，菌体OD6tltl是35.332。
[0062]实施例2:粉状毕赤酵母ACCC21153发酵罐分批发酵培养
[0063]1、粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的制备
[0064](I)按下列配方备料
[0065]将蛋白胨Sg、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、玉米浆15g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并补充至900mL，用5?8mol/L氢氧化钠调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、121 °C下灭菌20min ；
[0066](2)葡萄糖溶液配置及灭菌同实施例1 ;
[0067]( 3)将步骤(2)的葡萄糖溶液全部加入到灭过菌的步骤(I)的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基。
[0068]2、发酵罐发酵培养
[0069]A、斜面种子活化
[0070]同实施例1 ;
[0071]B、摇瓶种子制备
[0072]用接种环取一环步骤A的活化种子的单菌落，接入装有50mL YETO培养基的250mL三角瓶中，在30°C条件下，180r/min下振荡培养，当菌体OD6tltl达到10.0?12.0时即得摇瓶种子；
[0073]C、发酵培养
[0074]取步骤B的摇瓶种子按5%的接种量接入装液量为1.5L步骤I制备的粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32°C，转速200r/min，通风比1-3.5VVM,起始转速为300r/min每隔4h提高转速100r/min,提高到700r/min后保持不变。发酵24h，此时粉状毕赤酵母ACCC21153有效活菌数为17.3亿/mL，此时菌体0D_是46.787，发酵过程曲线见附图2。
[0075]实施例3:粉状毕赤酵母ACCC21153发酵罐分批补料发酵培养
[0076]1、粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的制备
[0077](I)按下列配方备料
[0078]将蛋白胨12g、磷酸二氢钾3.5g、硫酸镁0.45g、玉米浆15g混合，配制方法同实施例2，调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、121°C下灭菌20min ；
[0079](2)称取葡萄糖40g，用蒸馏水溶解并补充至10mL,在103.4kPa蒸汽压力、115°C下灭菌30min得葡萄糖溶液；
[0080](3)将步骤(2)的葡萄糖溶液全部加入到灭过菌的步骤(I)的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基。
[0081]2、发酵罐发酵培养
[0082]A、斜面种子活化
[0083]同实施例1 ;
[0084]B、摇瓶种子制备
[0085]用接种环取一环步骤A的活化种子的单菌落，接入装有40mL YETO培养基的250mL三角瓶中，在30°C条件下，200r/min下振荡培养，当菌体OD6tltl达到10.0?12.0时即得摇瓶种子；
[0086]C、补料用葡萄糖溶液的配制
[0087]称取葡萄糖80g，加蒸馏水溶解并补充至200mL，在103.4kPa蒸汽压力、115°C下灭菌20min得补料用葡萄糖溶液；
[0088]D、发酵培养
[0089]将步骤B的摇瓶种子按3.5%的接种量接入装液量为1.2L步骤I制备的粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32°C，转速300r/min，通风比1-3.5VVM,进行发酵培养。通过级联控制滴加5?8mol/L的NaOH溶液使发酵液pH保持在6.0,直至发酵结束。转速控制同实施例2。在发酵培养至13h时开始补料，向发酵罐中一次补入40mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2h进行一次补料，共补料5次，发酵至24h结束发酵，此时粉状毕赤酵母ACCC21153有效活菌数为28.3亿/mL，此时菌体OD6tltl是78.578，发酵过程曲线见附图3。
[0090]实施例4:粉状毕赤酵母ACCC20026发酵罐分批补料发酵培养
[0091]1、粉状毕赤酵母高密度发酵培养基的制备
[0092](I)按下列配方备料
[0093]将蛋白胨10g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.60g、玉米浆30g混合，配置方法同实施例1，调整pH到6.2，在103.4kPa蒸汽压力、118°C下灭菌25min ；
[0094](2)同实施例3;
[0095]( 3)将步骤(2)的葡萄糖溶液全部加入到灭过菌的步骤(I)的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC20026高密度发酵培养基。
[0096]2、发酵罐发酵培养
[0097]A、斜面种子活化
[0098]同实施例3 ；
[0099]B、摇瓶种子制备
[0100]同实施例3 ；
[0101]C、补料用葡萄糖溶液的配制
[0102]称取葡萄糖150g，加蒸馏水溶解并补充至200mL，在103.4kPa蒸汽压力、113°C下灭菌25min得补料用葡萄糖溶液；
[0103]D、发酵培养
[0104]将步骤B的摇瓶种子按4%的接种量接入装液量为1.5L步骤I制备的粉状毕赤酵母ACCC20026高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32°C，转速300r/min，通风比1-3.5VVM,进行发酵培养。发酵液pH调节、转速调节及补料发酵同实施例3，发酵至24h结束发酵，此时粉状毕赤酵母ACCC20026有效活菌数为30.0亿/mL，此时菌体OD6tltl是83.325。
【主权项】
1.对于一种粉状毕赤酵母高密度发酵工艺方法，其原料配方如下: 葡萄糖10?10g, 蛋白胨5?20g, 磷酸二氢钾I?6g， 硫酸镁0.1?2g， 玉米浆2?30g， 用蒸馏水补充至1000mL。
2.—种权利要求1所述的一种粉状毕赤酵母高密度发酵工艺方法的发酵培养基的制备方法，其步骤如下: (1)、将蛋白胨5?20g、磷酸二氢钾I?6g、硫酸镁0.1?2g、玉米衆2?30g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并补充至900mL，用5?8mol/L的NaOH调整pH到6.0?6.8，在103.4kPa压力、115?121 °C温度下灭菌20?30min得培养基； (2)、称取葡萄糖10?100g，加蒸馏水溶解并补充至10mL,在103.4kPa蒸汽压力、110?117°C温度下灭菌20?30min，得葡萄糖溶液； (3)、将步骤(2)得到的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤(I)的培养基中，得到粉状毕赤酵母高密度发酵培养基。
3.一种利用权利要求1所述的粉状毕赤酵母高密度发酵工艺方法的发酵培养基对粉状毕赤酵母进行高密度发酵，其步骤如下: (I )、将斜面保存的粉状毕赤酵母用接种环挑取一环，接入装有30?50mL YEPD培养基的三角瓶中，在28?40°C条件下，150?200r/min下振荡培养，当菌体OD6tltl达到10.0?12.0时即得摇瓶种子液； (2)、称取葡萄糖50?200g，加蒸馏水溶解并补充至200mL，在103.4kPa蒸汽压力、110?117°C温度下灭菌20?30min得补料用葡萄糖溶液； (3)、将发酵种子液按1%?5%的接种量接种于权利要求1所述的粉状毕赤酵母高密度发酵培养基中，发酵罐装液量40%?60% (V/V)，控制罐温28?40°C，通风比I?3.5VVM,起始转速300r/min,每隔4h转速提升100r/min,提高到700r/min后保持不变,在此发酵条件下，通过滴加5?8mol/L NaOH溶液使发酵液pH保持在6.0左右，直至发酵结束；当发酵至10?16h时开始补料,之后每隔2h补料，共补料5次,补料完成后继续发酵至20?30h结束发酵； 所述补料的成分为步骤(2)制得的补料用葡萄糖溶液，其浓度为250?1000g/L，每IL发酵液每次加入该补用葡萄糖溶液为40mL，使发酵体系中葡萄糖浓度为2?15g/L。
4.权利要求1-3任一项粉状毕赤酵母菌的高密度补料发酵方法，其特征在于所述的种子为粉状毕赤酵母菌株ACCC21153和粉状毕赤酵母菌株ACCC20026。
【专利摘要】本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种粉状毕赤酵母高密度发酵工艺方法，包括种子制备和发酵罐培养。发酵罐培养条件：装液量40%～60%（V/V），接种量1%～5%（V/V），控制温度28～40℃，通气量1～3.5VVM，起始转速300r/min，每隔4h提高转速100r/min，提高至700r/min保持不变，发酵周期20～30h。发酵过程中通过滴加NaOH溶液调节发酵液pH为6.0左右。发酵13h后间歇补加一定量的葡萄糖，20～30h后发酵结束，有效活菌数为30.0-35.0亿/mL。采用本发明的发酵工艺方法，不仅菌体量明显大幅度提高，而且工艺简洁、效率优于现有技术、生产成本更低。
【IPC分类】C12N1-16, C12R1-84
【公开号】CN104560743
【申请号】CN201310514319
【发明人】陈守文, 徐迪红, 杨欢, 冀志霞, 马昕
【申请人】武汉乐阳生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月25日