h内的迀移情况，图4-c表示癌细胞在有/无神经损伤时，癌细 胞在24h的平均迀移距离比较；
[0040] 图5表示在有/无药物处理时阻断癌细胞的迀移情况；
[0041] 其中，图5-a表示未进行药物处理时癌细胞的迀移情况，图5-b表示药物处理时癌 细胞的迀移情况，图5-c表示癌细胞在有/无药物处理时，癌细胞在24h的平均迀移距离比 较。
【具体实施方式】
[0042] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0043] 实施例1
[0044] 细胞共培养微流控芯片的制作方法如下：
[0045] 1)培养皿的涂层：在干净的培养皿（Corning，直径35mm)里加入ImLO. lmg/mL多 聚赖氨酸（PDL)，37°C孵育1-2小时后，制得表面涂覆有PLD的培养皿表面，用无菌水洗涤3 次以便除去未吸附的分子，无菌操作台中晾干备用。
[0046] 2)SU-8光刻模具的制作：使用多次光刻技术在硅片上制备出双层结构的凸型微 结构单元。首先用作图软件autoCAD设计出所需要的双层套刻结构，该图结构包括：位于 左右位置的直线型凸型线，以及连接所述左右凸型线的微凸型线阵列。所述的左右两条凸 型线的长度为2cm，宽度2mm，高度150 y m，左右两条凸型线平行且间距为450 y m。所述微 凸型线阵列的长度为450 y m，宽度为5 y m，高度为5 y m，微凸型线阵列平行且相互间距为 15 y m。所述左右直线型凸槽和连接的微凸槽阵列的底部在同一水平面上；然后打印为分别 率为3600dpi的胶片。
[0047] 利用甩胶机在干净的硅片基底上均匀的甩涂SU-8光刻胶，厚度5 y m，热板上65°C 烘烤lmin，在光刻机上第一次曝光后，将硅片放到热板上进行曝光后烘烤，65°C烘烤lmin， 这样第一层的凸型就转移到SU-8光刻胶上。再将SU-8甩涂到基片上，厚度150 ym，完成前 烘烤，将第二层掩膜板与第一层光刻图形进行对准，第二次曝光后和后烘烤，形成双层图形 结构的SU-8模板。
[0048] 3)制作PDMS芯片：将聚二亚甲基硅氧烷（PDMS)单体和固化剂按照10:1质量比 均匀混合，抽真空脱气后，倒入上述的凸型微结构单元的模具进行翻模，80°C烘烤4-5小时 固化，得到与所述微结构相对应的、具有双层凹型图案的PDMS印章。最后，将PDMS从硅片 上剥离，并在左右凹槽的两端打孔作为进行口和出样口，并切割合适大小。
[0049] 4)利用高压灭菌锅，对PDMS印章进行灭菌，121°C灭菌15min。然后置于80°C烘箱 烘干，备用。
[0050] 5)将步骤4)得到的PDMS印章取出，把有凹型图案的面向下与步骤1)的培养皿表 面接触，形成封闭的流通管腔，得到的细胞共培养微流控芯片如图1所示。
[0051] 实施例2
[0052] 利用本发明的细胞共培养微流控芯片进行细胞共培养，具体步骤如下：
[0053] 1)制备DRG神经元的悬浮溶液，细胞密度为6 X 107cellS/ml，然后把DRG神经元 通入左边的管腔中，在对面通道中加入培养基作为平衡，并用培养基浸泡芯片。培养基为 Neurobasal?基础培养基+2% B27补体+1 % PS双抗。恒温培养箱中培养，培养30-60分 钟，神经元细胞贴壁在右侧通道的培养皿表面上；72-96小时之后，由于高度限制，神经元 胞体限制在神经元通道中生长，而神经突生长并通过微凹型通道到达对面通道。
[0054] 2)制备不同的癌细胞（人前列腺癌细胞PC-3，人胰腺癌细胞Panc-I，或人乳腺癌 细胞MCF-7等）的悬浮溶液，调整密度至6 X 106cellS/ml。吸出PDMS印章周围及右侧空白 通道内的细胞培养液，在空白通道内种入癌细胞，并再次加入培养基浸泡芯片。移入恒温培 养箱中继续培养6-8小时，癌细胞贴壁在右侧通道的培养皿表面上。轻轻揭掉PDMS印章，洗 除未贴壁的细胞，并加入培养基，形成神经-癌细胞共培养体系，该体系如图2所示，以培养 通道中间无连接微通道作为对照，其中，图2-a是微流控芯片中含有中间连接的微通道，图 2-b是微流控芯片中不含有中间连接的微通道，通过图2可以看出，当培养通道中含有中间 连接的微通道时，可诱导神经突的定向生长，而当培养通道中不含有中间连接的微通道时， 无神经突的形成和作用。
[0055] 通过显微镜观察神经_癌细胞两种细胞在生长过程中的互相作用，以及癌细胞在 神经纤维作用下的迀移活动，结果如图3所示。其中，图3-a是癌细胞在有神经突引导下的 迀移情况，图3-b是癌细胞在无神经突引导下的迀移情况，通过图3可以看出，癌细胞在有 神经突的引导时，其24h的平均迀移距离要远大于无神经突引导的情况。
[0056] 3)诱导神经损伤：在制备细胞共培养微流控芯片的过程中，在揭掉PDMS之前，在 神经细胞通道中通入浓度为100 UM的6-羟基多巴胺（6-OHDA)诱导神经及神经突的损伤， 培养1小时。由于中间微凹槽的流体力作用，该处理不会对癌细胞造成影响。之后揭掉PDMS 印章，记录观察癌细胞的迀移情况，并以无神经损伤为对照，结果如图4所示。其中，图4-a 是无神经损伤时癌细胞的迀移情况，图4-b是用化学方法诱导神经纤维的损伤，癌细胞在 24h内的迀移情况，通过图4可以看出，癌细胞在有神经损伤时，其24h的平均迀移距离远小 于无神经损伤的情况。
[0057] 4)在步骤2)之前，对癌细胞进行预处理。将PC-3与相关表面受体拮据剂 进行孵育，37°C隔夜孵育。用到的药物属于抑制神经作用的药物，包括肾上腺素受体 阻滞剂（propranolol和penbutolol)，乙酰胆碱受体诘据剂（atropine, hyoscine和 mecamyIamine)等，处理癌细胞使用的药物浓度均为10 y M。然后按照步骤2)将PC-3 细胞种入通道，观察癌细胞迀移速度的改变，并以未进行药物处理为对照，结果如图5所 示。其中，图5-a是未进行药物处理时癌细胞的迀移情况，图5-b是药物（比如10 y M propranolol)处理时癌细胞的迀移情况，通过图5可以看出，采用药物处理癌细胞时，其 24h内的平均迀移距离要远小于未进行药物处理时癌细胞的平均迀移距离。
[0058] 通过上述实施例可以看出，本发明采用含有两层高度不同的嵌套微流控通道结 构，并对微通道的高度进行特殊设计，有助于诱导神经突的定向生长，以便直观地研宄在神 经微环境中神经-癌细胞的相互作用，同时还可以用于基于细胞和细胞之间作用的药物检 测，用以筛选相关神经药物的抗肿瘤效果，为发现抗癌药物的分析提供了新的途径，具有广 泛的应用价值。
[0059] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局 限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述细胞共培养微流控芯片包括培养通 道和微通道，所述培养通道通过微通道进行连接，所述培养通道的高度为100-300 μ m，所述 微通道的高度< 5 μ m。
2. 如权利要求1所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述培养通道的高度为 100-300 μ m，优选为 150 μ m ; 优选地，所述微通道的高度为3-5 μ m，优选为5 μ m。
3. 如权利要求1或2所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述培养通道的长度 为l-2cm ;所述培养通道的宽度为l-3mm，优选地，所述培养通道的宽度为2mm ; 优选地，所述微通道的长度为300-500 μ m ;优选地，所述微通道的宽度为3-5 μ m。
4. 如权利要求1-3任一项所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述培养通道 的间距为300-500 μπι; 优选地，所述微通道的间距为10-20 μ m。
5. 如权利要求1-4任一项所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述细胞共培 养微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷。
6. -种细胞共培养的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-5任一项所述细 胞共培养微流控芯片。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：分别将神经细胞和 癌细胞通入不同的培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长，构建神经-癌细胞共培 养体系。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经细胞的密度为 4X 107-7X 107cells/mL，优选为 6X107cells/mL ; 优选地，所述癌细胞的密度为4X 106-7X 106cells/mL，优选为6X 106cells/mL ; 优选地，所述神经细胞和癌细胞通入位于微通道两侧不同的培养通道。
9. 如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 制备神经元的悬浮溶液，细胞密度为4X 10T-7X 107cells/mL，恒温培养30-60min 后，神经元细胞贴壁在培养通道中，72-96h后，所述神经元细胞被限制在培养通道中，形成 神经元培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长； (2) 制备癌细胞的悬浮溶液，细胞密度为4X 106-7 X 106cellS/mL，恒温培养6-8h后，癌 细胞贴壁在步骤（1)对面的培养通道中，所述癌细胞被限制在该培养通道中，形成癌细胞 培养通道； (3) 待神经突生长并达到对面的癌细胞培养通道时，揭去聚二甲基硅氧烷印章，在开放 体系下观察神经-癌细胞的相互作用。
10. -种药物筛选的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-5任一项所述细胞 共培养微流控芯片。
【专利摘要】本发明涉及一种细胞共培养微流控芯片及其应用，所述细胞共培养微流控芯片包括培养通道和微通道，所述培养通道通过微通道进行连接，所述培养通道的高度为100-300μm，所述微通道的高度≤5μm。本发明通过所述微流控芯片构建了肿瘤的神经微环境，为研究肿瘤微环境、神经-癌症相互作用的基本研究提供了平台，同时还可应用于基于细胞和细胞之间作用的药物检测，用以筛选相关神经药物的抗肿瘤效果，为发现抗癌药物的分析提供新的途径。
【IPC分类】C12N5-0793, C12Q1-02, C12N5-079, C12M3-00, C12N5-09
【公开号】CN104611224
【申请号】CN201510037337
【发明人】蒋兴宇, 雷祎凤, 郑文富
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月23日