一种波棱瓜子多糖提取方法,该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及波棱瓜子多糖提取方法，该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物，属 于药物领域。
【发明内容】
[0002] 免疫性肝损伤通常由生物性和化学性刺激引起肝内细胞的激活，它是通过一系列 信号级联反应分泌大量炎症免疫相关细胞因子，经过各种不同细胞与细胞因子相互之间的 复杂作用，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤。免疫性肝损伤决定了疾病 的转归或发生发展。长期迀延不愈会导致肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终末病变。免 疫性肝损伤常见的原因为病毒感染，其模型动物的肝损伤病理病程类似于病毒性肝炎病理 病程。
[0003] 目前，病毒性肝炎仍然是世界范围内主要的公共卫生问题和最常见的肝病病因。 我国亦是病毒性肝炎的高发区，尤以乙型肝炎病毒（HBV)感染最为常见，严重威胁着人们 的健康。目前，尚无治疗乙型肝炎的特效药物和方法，治疗乙型肝炎的药物主要为西医常用 的干扰素、胸腺素、核苷类、疫苗等以及中医常用的黄芪粗制剂和以黄芪为主的复方、肝康 冲剂及苦参等药物，但疗效欠佳。因此，开发能有效治疗乙型病毒性肝炎的新药在临床上变 得尤为迫切。
[0004] 据报道，藏医药在防治病毒性肝炎的过程中取得了良好的成果，其对肝病的治疗 得到了国内外学者的广泛关注。
[0005] 波棱瓜子是藏药中治疗肝病的首选药物之一，在治疗肝病的过程中得到了广泛的 应用。现代药理研宄亦表明波棱瓜子总木脂素及脂肪油具有抗肝炎、抗乙肝病毒、抗肝损 伤、调节免疫等作用。据报道，植物多糖亦具有抗病毒、调节免疫、抗氧化等多种生理功能， 但目前尚未见波棱瓜子多糖护肝作用的研宄报道。
【发明内容】
[0006]
[0007] 本发明的技术方案是提供了一种波棱瓜子多糖提取方法，该提取方法得到的波棱 瓜子多糖提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的用途。
[0008] 本发明一种波棱瓜子多糖提取方法，它包括如下步骤：
[0009] a、脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入石油醚，在60 - 90°C下水浴回流4 一 6h，冷 却，离心；
[0010] b、水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，加入蒸馏水，KKTC水浴加热回流，冷却， 收集提取液，离心，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩；
[0011] c、Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂（三氯甲烧：正丁醇=5:1)，样 液比1:4 一 4 :1，剧烈震荡，离心，收集上清液；
[0012] d、沉淀：上述上清液中加入无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜 子多糖。
[0013] 进一步优选地，它包括如下步骤：
[0014] a、脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80°C下水浴回流2h，冷却， 离心，重复两次；
[0015] b、水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，依次加入10、8、6倍量蒸馏水，KKTC水浴 加热回流各提取2h、I. 5h、I. 5h，冷却，收集合并3次提取液，4000r/min离心5min，取上层清 液，再次抽滤后将滤液减压浓缩至每1ml药液相当于Ig原料药；
[0016] c、Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂（三氯甲烧：正丁醇=5:1)，样 液比3 :1，剧烈震荡25min，4000r/min离心5min，收集上清液，重复操作6次，最后所得上清 液；
[0017] d、沉淀：上述液体中加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得 到波棱瓜子多糖提取物。
[0018] 本发明还提供了所述的提取方法制备得到的波棱瓜子多糖提取物。
[0019] 本发明还提供了所述的波棱瓜子多糖提取物在制备保肝护肝的药物中的用途。
[0020] 其中，所述的药物是治疗免疫性肝损伤的药物。
[0021] 其中，所述的药物是保肝降酶的药物。
[0022] 其中，所述的药物是具有清除自由基、抗氧化、抗炎、调节免疫的药物。
[0023] 文献报道，波棱瓜子中具有保肝作用的大类成分为木脂素以及脂肪油，脂肪油在 提取的第一步（石油醚脱脂）中已几乎除尽，且脂肪油不溶于水；木脂素在植物中多以游离 状态存在，为脂溶性物质，难溶于水，且制备的最后一步即多糖沉淀乙醇体积分数已达80% 以上，进一步使残余的木脂素溶于上层清液乙醇中。因此，本发明波棱瓜子多糖提取物中不 含有木脂素类成分。
[0024] 本发明波棱瓜子多糖提取物遵循中医传统用药习惯，符合临床用药特点，提取方 法为水浴加热回流提取，工艺和提取设备简单，成本低廉，且相对安全，适合工业化大生产。
【附图说明】
[0025] 图1各组小鼠肝组织HE染色病理切片（A :空白组B :模型组C :阳性对照组D :多 糖低剂量组E :多糖中剂量组F :多糖高剂量组）
【具体实施方式】
[0026] 实施例1本发明波棱瓜子多糖提取物制备方法
[0027] 1)脱脂：波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80°C下水浴回流2h，冷却， 离心，重复两次。
[0028] 2)水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，依次加入10、8、6倍量蒸馏水，100°C水浴 加热回流各提取2h、I. 5h、I. 5h，冷却，收集合并3次提取液，4000r/min离心5min，取上层清 液，再次抽滤后将滤液减压浓缩至每1ml药液相当于Ig原料药。
[0029] 3) Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂（三氯甲烧：正丁醇=5:1)，样 液比3 :1，剧烈震荡25min，4000r/min离心5min，收集上清液，重复操作6次，最后所得上清 液。
[0030] 4)沉淀：上述液体中加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得 到波棱瓜子多糖。计算得提取率为3. 54%。
[0031] 以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
[0032] 试验例1本发明波棱瓜子多糖对ConA致免疫性肝损伤小鼠肝脏的保护作用的药 效学实验
[0033] 1.实验药品及试剂
[0034] 波棱瓜子多糖：由实施例1制备，多糖给药组剂量（按小鼠体重给药）分别为 0· 71g/kg、0. 99g/kg、l. 44g/kg，相当于生药量的 20g/kg、28g/kg、40. 8g/kg ;
[0035] 上述剂量多糖用蒸馏水溶解配制备用；
[0036] 联苯双酯滴丸，由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供；
[0037] 刀豆球蛋白A(ConA)，购自美国Sigma公司；
[0038] 丙氨酸氨基转移酶（ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶（AST)、乳酸脱氢酶（LDH，批 号）、超氧化物歧化酶（T-SOD)、丙二醛（MDA)、总蛋白（TP)、一氧化氮（NO)试剂盒，均购自 南京建成生物工程研宄所提供；
[0039] 白细胞介素6 (IL-6) ELASA试剂盒，由苏州卡尔文生物科技有限公司提供；
[0040] 无菌磷酸缓冲液（PBS)，由Bioroc公司提供。
[0041] 2.实验方法
[0042] 60只健康雄性昆明种小鼠，18_22g，随机分为空白组、模型组、联苯双酯（阳性对 照）组及波棱瓜子多糖低、中、高剂量组，每组10只。
[0043] 波棱瓜子多糖低、中、高剂量给药组小鼠每天分别按体重igO. 71、0. 99、1. 44g/kg 多糖；
[0044] 阳性对照组小鼠 igO. 2g/kg联苯双酯；
[0045] 联苯双酯及多糖均用蒸馏水混悬和溶解；
[0046] 正常组与模型组小鼠 ig20mL/kg的蒸馏水；
[0047] 连续 ig8d ;
[0048] 采用一次性尾静脉注射ConA建立免疫性肝损伤小鼠模型：末次给药（已禁食 9h) Ih后，除正常组外，其余小鼠尾静脉注射30mg/kg ConA。
[0049] 8h后，称量小鼠体重，摘眼球取血，分离血清，检测ALT、AST、NO、LDH、IL-6各项指 标；
[0050] 眼球取血后立即处死小鼠并剖取肝脏、脾脏，滤纸擦试，称重，计算肝脏、脾脏脏器 指数（脏器重量/体重X 100%);
[0051] 剪取部分肝脏组织，冰浴中用冷生理盐水制成10%的肝匀浆，离心，取上清液，检 测TP、SOD、MDA各项指标；
[0052] 剪取各组小鼠的肝脏相同部位肝组织（肝左叶），10%甲醛（PBS配制）固定，HE 染色，光镜下观察肝组织损伤程度。
[0053] 统计学处理：所得数据均采用I ± s表示，用SPSS17. 0软件进行方差分析及独立 样本T检验，肝脏组织的炎性坏死程度根据等级分组评分后，采用Riditu检验进行统计学 处理。P < 0. 05或P〈0. 01认为有显著性差异。
[0054] 3.实验结果
[0055] 1)波棱瓜子多糖对脏器指数的影响，实验结果见表1。
[0050] 表1波棱瓜子多糖对免疫性肝损伤小鼠脏器指数的影响? ±s，η = 10)
[0057]
【主权项】
1. 一种波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于：它包括如下步骤： a、 脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入石油醚，在60-90°C下水浴回流4-6h，离心； b、 水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，加入蒸馏水，KKTC水浴加热回流，冷却，收集 提取液，离心，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩； c、 Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂（三氯甲烧：正丁醇=5:1)，样液比 I :4_4 :1，剧烈震荡，离心，收集上清液； d、 沉淀：上述上清液中加入无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多 糖。
2. 根据权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于：它包括如下步骤： a、 脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80°C下水浴回流2h，冷却，离 心，重复两次； b、 水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，依次加入10、8、6倍量蒸馏水，KKTC水浴加热 回流各提取2h、l. 5h、l. 5h，冷却，收集合并3次提取液，4000r/min离心5min，取上层清液， 再次抽滤后将滤液减压浓缩至每1ml药液相当于Ig原料药； c、 Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂（三氯甲烧：正丁醇=5:1)，样液比 3 :1，剧烈震荡25min，4000r/min离心5min，收集上清液，重复操作6次，最后所得上清液； d、 沉淀：上述液体中加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波 棱瓜子多糖提取物。
3. 权利要求1或2所述的提取方法制备得到的波棱瓜子多糖提取物。
4. 权利要求3所述的波棱瓜子多糖提取物在制备保肝护肝的药物中的用途。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗免疫性肝损伤的药物。
6. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是保肝降酶的药物。
7. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是具有清除自由基、抗氧化、 抗炎、调节免疫的药物。
【专利摘要】本发明提供了一种波棱瓜子多糖提取方法，它包括如下步骤：a、脱脂；b、水浴加热回流提取；c、Sevag法除蛋白；d、沉淀。本发明还提供了提取方法制备得到的波棱瓜子多糖提取物及其用途。本发明波棱瓜子多糖提取物遵循中医传统用药习惯，符合临床用药特点，提取方法为水浴加热回流提取，工艺和提取设备简单，成本低廉，且相对安全，适合工业化大生产。
【IPC分类】A61P29-00, A61P37-02, A61K31-715, A61P1-16, A61P39-06, C08B37-00
【公开号】CN104804107
【申请号】CN201510201883
【发明人】张梅, 李春沁, 刘美琳, 雷有成, 王紫燕
【申请人】成都中医药大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月24日